miR-495-3p對山羊卵巢顆粒細胞功能的影響

王 磊，何莉娜，唐 雪，李碧筠，黃思藝，王鈺錕，徐德軍，趙中權

(西南大學動物科學技術學院，重慶 400715)

卵泡是卵巢的基本功能單位，其生長發育對雌性哺乳動物的生殖進程起決定作用[1]。卵泡的生長發育是一個高度精確、有序且具有周期性的過程[2]，從原始卵泡的激活開始，逐漸生長發育成熟直至選擇為優勢卵泡或閉鎖，此過程伴隨著卵母細胞和周圍體細胞的生長，其中顆粒細胞(granulosa cells, GCs)的生長發育對這一過程的影響尤為重要[3]。

GCs的增殖和凋亡是卵泡成熟或閉鎖的重要因素和必要條件[4]，GCs的增殖可以促進卵泡發育成熟，而GCs凋亡則引發卵泡的閉鎖[5]，同時，GCs還是卵巢中類固醇激素生成的主要來源，卵泡液中的類固醇激素維持卵巢正常的生理功能，其主要包括雌二醇(estrogen, E2)和孕酮(progesterone, P4)[6]。哺乳動物約有99%卵泡發育停滯或閉鎖，只有1%的卵泡可以發育成熟并排卵，卵泡的成熟或閉鎖對于雌性哺乳動物維持健康的生殖系統動態平衡十分重要[7]，因此，長期以來，卵泡的發育和閉鎖機制一直是生殖生物學的研究熱點。

microRNA(miRNA)廣泛參與原始卵泡的形成、卵泡的募集、選擇和閉鎖等雌性哺乳動物的生殖過程[8]。miRNA主要通過抑制靶基因的表達進而調節GCs增殖和凋亡[9]，例如：miR-181被證實通過減少PCNA的積累和靶向ACVRIA來抑制GCs的增殖[10]；而過表達miR-320則能抑制小鼠GCs的增殖[11]；同時，long non-coding RNA tcons-00814106通過海綿介導miR-1343調控豬GCs增殖和凋亡[12]。此外，miRNA對于類固醇激素合成也發揮重要的調節作用，例如：miR-133b可以直接靶向FOXL2從而抑制FOXL2介導的StAR和CYP19A1的轉錄，從而促進E2的生成[13]；而miR-378通過靶向CYP19A1抑制E2的合成[14]；miR-375參與調控CRH的表達進而抑制GCs合成E2[15]。

最近研究報道，miR-495參與調控腔前卵泡的生長發育[16]。同時，與非妊娠期相比，妊娠早期miR-495高表達，暗示其可能參與早期妊娠的建立[17]。而在綿羊繁殖進程中，miR-495-3p通過直接或間接方式影響促性腺激素釋放激素的活性和釋放[18]。但是，miR-495-3p調控卵巢卵泡發育的分子機制尚不明確。為了揭示miR-495-3p在山羊卵巢GCs中的功能及其調控機制，本研究轉染miR-495-3p mimics和inhibitor，分析其對山羊卵巢GCs凋亡、增殖、周期、類固醇激素分泌及相關基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗主要試劑

DMEM/F12培養基、胎牛血清FBS(HyClone，美國)，FSHR一抗(稀釋比例1∶200，葆光生物，中國)，生物素標記二抗(稀釋比例1∶20，葆光生物，中國)，辣根酶標記的工作液、DAB工作液、CCK-8、BCA試劑盒(葆光生物，中國)，EndoFectinTM(萊博斯，中國)，Opti-DMEM(HyClone，美國)，RNAiso(Invitrogen，美國)，PrimeScriptTM RT Master Mix、MiR-XTMmiRNA FirstStrand Synthesis(TaKaRa，中國)，Annexin V-PE(Biolegend，中國)， 7-AAD(Biolegend，中國)，PI/RnaseA(SeaBiotech，中國)，ELISA試劑盒(博諾恒，中國)，細胞裂解液(Solarbio，中國)。

1.2 卵巢采集與細胞培養及轉染

本試驗嚴格按照國際動物福利合作委員會(ICCAW)和西南大學動物實驗倫理委員會(西南大學〔2017〕7號)要求。從西南大學羊場選取3～4月齡的大足黑山羊母羊，屠宰后收集新鮮卵巢，置于37 ℃ 的生理鹽水中1 h內轉運至實驗室。山羊卵巢GCs收集培養方式同Wang等[19]的報道，GCs培養于DMEM/F12培養基中，補充10%胎牛血清，置于細胞培養箱中37 ℃、5% CO2的條件培養。將miR-495-3p mimics、miR-495-3p mimics NC、miR-495-3p inhibitor、miR-495-3p inhibitor NC(序列見表1)分別轉染至GCs中，每組3個重復，細胞轉染依據制造商說明書：5 μL miR-495-3p mimics/NC、inhibitor /NC(100 nmol·L-1)或EndoFectinTMMax轉染試劑用Opti-DMEM分別稀釋至150 μL，室溫靜置5 min。將稀釋的miR-495-3p mimics/NC或inhibitor /NC溶液以及EndoFectinTMMax溶液輕柔混合，室溫靜置20 min，向6孔板中逐滴添加RNA-EndoFectinTM復合物，在CO2培養箱中37 ℃孵育24～48 h。

1.3 細胞免疫化學染色

將貼壁生長的細胞消化后制成單細胞懸浮液，轉入放有細胞爬片的12孔板中，培養24 h，用4%的多聚甲醛固定細胞爬片后用0.5%的Triton X-100溶液通透30 min，隨后用5% 的BSA溶液室溫封閉 30 min。結束封閉的細胞爬片滴加用1%BSA溶液稀釋的FSHR一抗，置于37 ℃，5% CO2培養箱中孵育2 h。無菌PBS洗3次(每次5 min)，滴加用1%BSA溶液稀釋的生物素標記二抗，置于37 ℃， 5% CO2培養箱中孵育30 min。最后，細胞爬片與辣根酶標記的工作液以及新配制的DAB工作液共孵育。FSHR陽性細胞膜被染成棕色，細胞核染成藍色，利用倒置顯微鏡采集圖像。

1.4 CCK-8 檢測

CCK-8檢測細胞活性，在96孔板中培養或轉染GCs(1×104個·孔-1)，轉染后放入CO2培養箱培養，設置3個時間梯度(24、36、48 h)，每個梯度4個 重復。每孔加入10 μL的CCK-8試劑，置于CO2細胞培養箱中孵育2 h。隨后使用酶標儀檢測混合物在450 nm 處的吸光度，計算細胞增殖活力。

1.5 細胞凋亡及細胞周期檢測

轉染36 h后收集GCs，利用緩沖液重懸細胞，調節細胞密度為107個·mL-1，在流式管中加入100 μL細胞懸液，隨后分別加入5 μL Annexin V-PE 和5 μL 7-AAD混合均勻，室溫避光孵育15 min， 使用流式細胞術檢測細胞凋亡。轉染36 h后收集GCs，每個樣本加入500 μL提前配置好的PI/RNA染色工作液(PI∶RnaseA=9∶1)，室溫避光孵育1 h，利用流式細胞術檢測細胞周期，用Modfit軟件進行數據分析。

1.6 ELISA檢測

細胞轉染36 h后，收集細胞上清液50 μL，使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測E2和P4水平。根據試劑盒說明書，使用酶標儀在450 nm波長下測定不同處理組的吸光度。通過對標準曲線的線性回歸，計算出相應的樣品濃度。

1.7 qRT-PCR檢測基因表達

用RNAiso試劑從GCs中提取總RNA，用Nanodrop1000評估RNA的純度和濃度。利用PrimeScriptTM RT Master Mix將mRNA逆轉錄成cDNA。根據MiR-XTMmiRNA FirstStrand Synthesis說明書要求，miRNA逆轉錄為cDNA。根據TaKaRa 公司TB Green? Premix Ex TaqTMⅢ(Tli RNaseH Plus)進行qRT-PCR，反應體系為15 μL： TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)7.5 μL， PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)0.6 μL， PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.6 μL，RT 反應液(cDNA 溶液)1.2 μL， 滅菌水5.1 μL。反應條件為：第一階段預變性95 ℃ 30 s，循環一次；第二階段PCR反應95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環40次，熔解曲線根據引物不同設置為65～95 ℃，每0.5 ℃讀取一次Ct值。相對表達量采用2-ΔΔCT法計算。編碼基因表達量歸一化為β-actin的相對表達量，miRNA表達量歸一化為U6的相對表達量。所有qRT-PCR反應均為4個重復，所用引物見表2。

1.8 Western blot檢測蛋白水平

細胞轉染后36 h，用含1%蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的細胞裂解液裂解細胞，混合物4 ℃離心，收集細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度?？偟鞍滋崛∫涸?2% SDS PAGE凝膠上分離，并在硝化纖維素膜上印跡。用5%脫脂牛奶在4 ℃ 的TBST緩沖液中封閉2 h，結束后將膜與一抗4 ℃孵育過夜，隨后二抗孵育2 h，用ECL顯影液(A液∶B液=1∶1)顯影，Image LAS-4000系統檢測化學發光，Image J軟件分析蛋白灰度。

1.9 統計分析

利用Prism-6軟件進行統計分析，多個數據的比較用單因素方差(One-Way ANOVA)分析，兩組數據比較用獨立t檢驗，試驗重復3次以上，數據結果采用“平均值±標準誤(Mean±SEM)”表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結 果

2.1 山羊卵巢GCs的分離鑒定及miR-495-3p轉染效率驗證

山羊卵巢GCs最初分離培養呈現圓點狀，培養24 h后貼壁生長，呈現長梭形(圖1A)。為了檢測本研究分離培養的GCs純度，利用GCs中特異性表達的FSHR來鑒定GCs。染色后可觀察到GCs膜被染成棕色，細胞核染成藍色(圖1B)。為研究miR-495-3p在卵巢GCs中的作用，將miR-495-3p mimics、mimics NC、miR-495-3p inhibitor和inhibitor NC轉染到GCs中，分別在24、36和48 h觀察細胞轉染情況(圖1C)，并用qRT-PCR驗證其轉染效率(圖1D)。結合細胞熒光信號，轉染miR-495-3p mimics 36 h時miR-495-3p表達量最高(P<0.01)。因此，后續試驗轉染時間為36 h。由于miRNA inhibitor的干擾原理，未檢測到miR-495-3p表達量變化。

2.2 miR-495-3p對GCs凋亡的影響

為探究miR-495-3p對GCs凋亡的影響，轉染miR-495-3p mimics、mimics NC、miR-495-3p inhibitor和inhibitor NC 36 h后，利用流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果顯示，與mimics NC組相比，miR-495-3p mimics極顯著升高細胞凋亡率(圖2A、2B、2E，P<0.01)；而與inhibitor NC組相比，miR-495-3p inhibitor極顯著下調細胞凋亡率(圖2C～E，P<0.01)。qRT-PCR檢測凋亡相關基因相對表達水平，結果顯示，與mimics NC組相比，miR-495-3p mimics顯著上調BAXmRNA相對表達水平(P<0.05)，極顯著下調BCL2 mRNA相對表達水平(P<0.01)；與inhibitor NC組相比，miR-495-3p inhibitor極顯著下調BAXmRNA相對表達水平(P<0.001)，但對BCL2的表達無顯著影響(圖2F)。Western blot檢測蛋白表達水平結果與qRT-PCR結果趨勢相一致(圖2G、2H)。以上結果表明，過表達miR-495-3p可以促進GCs凋亡，而抑制miR-495-3p可以阻礙細胞凋亡。

A. 貼壁生長的山羊卵巢GCs；B. 細胞免疫組化鑒定山羊卵巢GCs；C.轉染miR-495-3p mimics、mimics NC、miR-495-3p inhibitor和inhibitor NC細胞熒光圖(24、36、48 h)；D. 轉染36 h后，qRT-PCR檢測miR-495-3p mRNA表達量：ns表示差異不顯著，*表示差異顯著P<0.05，**表示差異極顯著P<0.01A. Goat ovary GCs that grow adherently; B. Cellular immunohistochemistry to identify goat ovarian GCs; C. Fluorescence images of cells transfected with miR-495-3p mimics, mimics NC, miR-495-3p inhibitor and inhibitor NC (24, 36, 48 h); D. 36 h after transfection, the expression of miR-495-3p mRNA was detected by qRT-PCR: ns indicates that the difference is not significant, * indicates the significant difference P<0.05, ** indicates the extremely significant difference P<0.01圖1 卵巢GCs的分離鑒定及miR-495-3p轉染Fig.1 Isolation and identification of ovarian GCs and miR-495-3p transfection

A、B、C、D. 流式細胞術檢測GCs轉染miR-495-3p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC 36 h后的細胞凋亡：UL表示死亡細胞，UR表示晚期凋亡細胞，LR表示早期凋亡細胞，LL表示活的非凋亡細胞；E. 柱狀圖顯示凋亡細胞的百分比；F. qRT-PCR檢測細BAX、BCL2 mRNA相對表達量；G、H. Western blot檢測BAX、BCL2的蛋白相對表達量。*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001，下同A, B, C, D. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of GCs on 36 h after transfection of miR-495-3p mimics, mimics NC, inhibitor and inhibitor NC: UL stands for dead cells, UR stands for late apoptotic cells, LR stands for early apoptotic cells, and LL stands for live non-apoptotic cells; E. The histogram shows the percentage of apoptotic cells; F. qRT-PCR detects the relative expression of BAX and BCL2 mRNA; G, H. Western blot was used to detect the relative expression of BAX and BCL2 proteins. *. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001,the same as below圖2 miR-495-3p促進卵巢GCs的凋亡Fig.2 miR-495-3p promotes the apoptosis of ovarian GCs

2.3 miR-495-3p對GCs增殖的影響

用CCK-8檢測不同轉染時間細胞的增殖活力，分析miR-495-3p對細胞增殖的影響。結果顯示，轉染24 h時，過表達或抑制miR-495-3p對細胞的增殖活力無顯著影響(P>0.05)；轉染36 h時，與mimics NC組相比，miR-495-3p mimics顯著降低細胞增殖活力(P<0.05)，而inhibitor組無顯著變化；轉染48 h時，與對照組相比miR-495-3p mimics組和miR-495-3p inhibitor組顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.001)降低細胞增殖活力(圖3A)，表明隨著轉染時間的增加，細胞的增殖活力逐漸下降，并且細胞增殖結果與miR-495-3p在GCs中的轉染結果一致(圖1D)。qRT-PCR結果顯示，過表達或抑制miR-495-3p對增殖標志基因PCNAmRNA的相對表達水平無顯著影響(圖3B，P>0.05)，但Western blot結果發現，過表達miR-495-3p顯著降低PCNA的蛋白表達水平(圖3C，P<0.05)。綜上表明，過表達miR-495-3p可以抑制GCs增殖。

A.CCK8檢測miR-495-3p mimics、mimics NC、inhibitor和inhibitor NC處理組的細胞活力；B. qRT-PCR檢測細胞增殖標志基因PCNA的mRNA表達；C. Western blot檢測增殖標志基因PCNA蛋白的表達A. CCK8 detect the cell viability of miR-495-3p mimics, mimics NC, inhibitor and inhibitor NC treatment groups; B. qRT-PCR detect the mRNA expression of the cell proliferation marker gene PCNA; C. Western blot was used to detect the protein expression of PCNA圖3 miR-495-3p抑制GCs的增殖Fig.3 miR-495-3p inhibits the proliferation of GCs

2.4 miR-495-3p對GCs細胞周期進程的影響

為明確miR-495-3p影響細胞增殖的具體分裂時期，利用流式細胞術檢測細胞周期分布，結果發現過表達miR-495-3p極顯著降低了G1期比率(P<0.01)，顯著增加G2/M期比率(P<0.05)，對S期沒有顯著影響(圖4A、4B、4E)，而抑制miR-495-3p對細胞周期沒有顯著影響(圖4C、4D、4E，P>0.05)。qRT-PCR檢測細胞周期相關基因的相對表達水平，與對照組相比，發現過表達miR-495-3p顯著降低了CDK4(P<0.001)和CCND1(P<0.05)的mRNA水平，但其對CCNE1沒有顯著影響(P>0.05)；抑制miR-495-3p極顯著降低CCNE1的mRNA水平(P<0.01)，而對CDK4和CCND1的mRNA水平無顯著影響(圖4F)。結果表明，過表達miR-495-3p引起細胞周期阻滯在G2/M期。

A、B、C、D. 流式細胞術檢測miR-495-3p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC處理組的細胞周期；E. 柱狀圖顯示細胞周期分布的百分比；F. qRT-PCR檢測與細胞周期相關基因(CDK4、CCND1和CCNE1)的mRNA表達A, B, C, D. Flow cytometry detect the cell cycle of miR-495-3p mimics, mimics NC, inhibitor, inhibitor NC treatment groups; E. The histogram shows the percentage of cell cycle distribution; F. qRT-PCR detects the mRNA expression of genes related to cell cycle (CDK4, CCND1 and CCNE1)圖4 miR-495-3p阻滯GCs的細胞周期進程Fig.4 miR-495-3p blocks the cell cycle progression of GCs

2.5 miR-495-3p對GCs類固醇激素分泌的影響

利用ELISA試劑盒檢測GCs培養液上清中的E2和P4含量。結果表明，過表達或抑制miR-495-3p均顯著促進E2(P<0.01)和P4(P<0.001，P<0.05)的分泌(圖5A、5B)。qRT-PCR和Western blot檢測類固醇激素合成相關基因和蛋白的相對表達水平，與對照組相比，過表達miR-495-3p顯著升高3β-HSD(P<0.001)、CYP11A1(P<0.01)和CYP19A1(P<0.05)的mRNA和蛋白表達水平(圖5C、5D、5F、5G)，但對StAR無顯著影響(圖5C、5E，P>0.05)。抑制miR-495-3p極顯著增加CYP11A1的mRNA和蛋白的表達水平(圖5C、5F，P<0.01)，極顯著降低StAR的mRNA和蛋白表達水平(圖5C&E，P<0.001)，極顯著降低3β-HSD的mRNA表達水平(P<0.01)，但對蛋白的表達無顯著影響(圖5C、5D)，同時，抑制miR-495-3p對CYP19A1的mRNA和蛋白表達水平并無顯著影響(圖5C、5G，P>0.05)。

3 討 論

miRNA在卵巢中的表達十分豐富，并且對卵巢的生理功能起著重要的調節作用[20]。在本研究中，過表達miR-495-3p促進GCs凋亡，這一結果與其它miRNA在卵巢GCs中的研究結果類似。Tu等[21]報道miR-10家族在人、大鼠和小鼠中均可誘導GCs凋亡，相反，Zhang等[22]發現，miR-21-5p靶向Smad7抑制豬卵巢GCs凋亡，表明miRNA對GCs凋亡具有復雜的調節作用。miR-144[23]和miR-29[24]在促進卵巢GCs凋亡的同時伴有BAX、BCL2和caspase3等凋亡基因的表達量變化，通常細胞凋亡途徑分為內部線粒體途徑和死亡受體介導的外部凋亡途徑，其中內部凋亡途徑主要受BCL2家族蛋白調控，而外部凋亡途徑的主要調控因子為效應凋亡蛋白酶caspase3[25]。本試驗證實了miR-495-3p能夠引起BAX和BCL2表達量的變化，表明miR-495-3p可能通過線粒體凋亡途徑促進GCs凋亡。

GCs的增殖對卵泡發育成熟起著至關重要的作用。本研究發現，miR-495-3p呈時間依賴性地抑制GCs增殖并下調PCNA蛋白水平，過表達miR-495-3p將細胞周期阻滯在G2/M期。在腫瘤細胞中，CDK的表達變化導致細胞周期紊亂[26]，抑制CDK4可以影響細胞G1期阻滯，顯著抑制細胞增殖[27]，而在骨肉瘤的研究中，過表達miR-495-3p能夠降低CDK4、CDK6、CCND1和CCNA2表達水平從而抑制骨肉瘤細胞增殖[28]。因此，miR-495-3p通過抑制CDK4和CCND1的表達可能阻滯了細胞周期進程，但是miR-495-3p具體通過何種途徑影響GCs周期有待進一步研究。

哺乳動物在整個發情周期，卵泡會經歷形態和生理功能變化，這些變化是由卵巢中GCs分泌的類固醇激素E2和P4調控介導。有研究表明，哺乳動物體內E2濃度越高，體內卵泡數量和體積會逐漸增加[29]，一般來說，E2合成量取決于兩種情況:一是參與E2合成酶的活性;二是分泌E2細胞的數量[30]，并且研究發現，將E2合成過程中的關鍵酶CYP19A1敲除后，會使小鼠出現E2分泌不足從而影響卵泡的發育[31]。本研究中，同抑制miR-143[32]或miR-764-3p[33]可以增加小鼠卵巢GCs中E2分泌的結果相似，過表達miR-495-3p后，在mRNA和蛋白水平均顯著增加E2合成限速酶CYP19A1的表達量。此外，P4能夠調節卵泡的生長，影響排卵及卵子的質量，因此P4是評價卵巢功能的重要指標之一[34]，在P4合成過程中，StAR將膽固醇從線粒體外運送到線粒體內，隨后CYP11A1促進膽固醇向孕烯醇酮的轉化，孕烯醇酮在3β-HSD的作用下生成P4[35]，CYP11A1作用的膽固醇向孕烯醇酮轉化過程是P4合成的限速步驟[36]。本研究結果顯示，過表達miR-495-3p可上調3β-HSD和CYP11A1表達，這一結果說明過表達miR-495-3p可以通過上調3β-HSD和CYP11A1促進膽固醇到孕烯醇酮再到P4的合成過程。值得注意的是，本試驗發現，抑制miR-495-3p顯著降低StAR蛋白表達，這將導致膽固醇轉運至線粒體膜內的量減少，進而限制P4的合成，但試驗結果卻發現miR-495-3p促進P4合成，這可能由于抑制miR-495-3p提高了P4合成限速酶CYP11A1的表達，進而促進GCs分泌P4。相似的，在豬卵巢GCs中，抑制miR-21-5p可以抑制E2和促進P4分泌；抑制miR-130a-3p促進山羊卵巢GCs中E2和P4的分泌[37]；miR-101-3p增加奶山羊GCs培養液中E2和P4的含量[38]，這表明，miRNA調控GCs合成孕酮的機制可能比預想的更為復雜。

4 結 論

本研究結果表明，miR-495-3p促進山羊卵巢GCs凋亡、抑制其增殖，將細胞周期阻滯在G2/M期，刺激類固醇激素的分泌。表明miR-495-3p在山羊卵泡發育中具有重要的調控作用。

A、B. ELISA檢測miR-495-3p mimics、mimics NC、inhibitor和inhibitor NC處理組上清液中E2和P4含量；C. qRT-PCR檢測類固醇激素合成相關基因的mRNA表達量；D、E、F、G. Western blot檢測類固醇激素合成相關基因3β-HSD、StAR、CYP11A1、CYP19A1的蛋白表達量A, B. ELISA was used to detect the contents of E2 and P4 in the supernatant of miR-495-3p mimics, mimics NC, inhibitor and inhibitor NC treatment groups; C. qRT-PCR detection of mRNA expression of steroid hormone synthesis-related genes; D, E, F, G. Western blot was used to detect the protein expression of steroid hormone synthesis-related genes 3β-HSD, StAR, CYP11A1 and CYP19A1圖5 miR-495-3p促進GCs類固醇激素分泌Fig.5 miR-495-3p promotes the secretion of steroid hormones in GCs