miRNA-148a-3p的生物信息學分析及其在小鼠不同組織中的表達水平檢測

劉芳君，藍吳濤，馬悅悅，李鵬飛，張 磊，朱芷葳*

(1.山西農業大學生命科學學院，太谷 030801； 2.忻州師范學院，忻州 034000)

miRNA是一種內源性的、大約22個核苷酸的非編碼RNA，可以與其靶標的3′非翻譯區上的位點結合，實現翻譯抑制[1-2]。自從1993年首次發現miRNA以來，人們一直在積極研究miRNA在病理和生理條件下的關鍵作用[3]。最新證據表明，miRNA在腫瘤的發生、發展和臨床治療中發揮著重要作用。大約50%的miRNA位于腫瘤相關的脆弱部位或基因組區域，這表明它們在癌癥中具有潛在的關鍵作用[4]。miRNA直接或間接的與癌基因和抑癌基因相互作用并調節其表達，表明miRNAs可以作為一種新的腫瘤診斷和預后的生物標志物。在一系列生物學過程中，miR-148a家族同許多miRNA家族一樣具有共同的功能，包括細胞發育和分化[5]。目前，miR-148a的研究主要集中在病理生理條件下，如膽管癌、食道癌、卵巢癌和結腸癌[6-9]。miR-148a調控胃癌發生發展的作用及其在胃癌細胞中的具體機制已經確定[10-11]。miR-148a也能調節黑色素瘤的形成和進展[12]。因此miR-148a在腫瘤領域的研究是十分有前景的。miR-148a-3p是miR-148家族的一員，已有研究結果顯示，其在多種腫瘤組織和細胞系中表達失調。在骨肉瘤組織和細胞系中miR-148a-3p表達較低，而過表達miR-148a-3p可以通過抑制PIK3CA繼而抑制MG-63和U2OS細胞的增殖、遷移和侵襲，并降低骨肉瘤細胞在裸鼠體內的致瘤性[13]。Wang等[14]研究發現，miR-148a-3p在上皮性卵巢癌中表達降低，而過表達miR-148a-3p可抑制上皮性卵巢癌SKOV3細胞的侵襲和增殖能力。

本研究通過分析miR-148a-3p在不同組織中的表達水平，預測miR-148a-3p靶基因的功能和參與的通路，并構建基因互作網絡，為進一步闡明miR-148a在癌癥中的功能提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗小鼠為6周齡C57BL/6 J小鼠，體重(24±2)g，按照山西農業大學動物試驗倫理委員會的要求，對小鼠進行飼養。采用脊椎脫臼法處死小鼠后，分別收集3只小鼠的胃、肺、脾、皮膚、肝、心和腎7個組織，置于液氮研磨，每組3個重復，進行3次平行試驗。

1.2 儀器與試劑

TRIzol購自賽默飛世爾科技有限公司；miRcute miRNA First-Strand cDNA合成試劑盒購自天根科技(北京)有限公司；TB Green Advantage qPCR PreMix購自寶日醫生物技術(北京)有限公司。

1.3 小鼠組織總RNA提取和反轉錄

將不同組織置于研缽中，加入液氮研磨。使用TRIzol法提取組織總RNA，Nanodrop2000C檢測總RNA的質量和純度。

根據miRcute miRNA First-Strand cDNA合成試劑盒步驟進行總miRNA的反轉錄。第一步，將1 μg RNA、0.2 μL大腸桿菌聚(A)聚合酶(5 U·μL-1)、 1 μL 10×聚合酶緩沖液和2 μL 5×rATP液加入離心管中，加ddH2O補足至10 μL后37 ℃孵育60 min。第二步，將2 μL第一步的溶液、2 μL 10×引物、2 μL 10×RT緩沖液、1 μL dNTPs、1 μL RNasin(40 U·μL-1)和0.5 μL Quant Rtase混合，加入11.5 μL的無核糖核酸酶的ddH2O于37 ℃下孵育60 min。

1.4 小鼠不同組織中miR-148a-3p表達的檢測

為了確定miR-148a-3p在小鼠胃、肺、脾、皮膚、肝、心和腎組織中的表達情況，用miR-148a-3p的通用引物和序列特異性正向引物5′-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3′進行qRT-PCR。U6正、反向引物序列分別為5′-TTGTGGAAAGGACGAAACAC-3′和5′-GGCCATGCTAATCTTCTG-3′。反應體系包括1 μL cDNA、0.4 μL反向引物和0.4 μL序列特異性正向引物，5 μL TB Green Advantage qPCR PreMix和3.2 μL的ddH2O，按照TaKaRa熒光定量試劑盒說明書設置條件。

1.5 miR-148a-3p轉錄因子結合位點(TFBS)的預測

在Ensembl數據庫中搜索miR-148a-3p的前體，確定其上游約10 kb的片段。利用Promoter Scan和TRANSFAC數據庫對miR-148a-3p的TFBS進行預測。

1.6 miR-148a-3p的保守性和靶基因預測

在miBase中檢索并分析不同物種的miR-148a-3p序列，包括獼猴、大猩猩、人、牛、黑猩猩、褐家鼠、小鼠、山羊和家犬。為了保證數據的準確，本研究利用TargetScan、miRanda 和PicTar 3個軟件對miR-148a-3p的靶基因進行預測。3個軟件預測結果的交集作為最后的結果。

1.7 miR-148a-3p 靶基因的GO和KEGG富集分析

為了分析miR-148a-3p靶基因的作用，利用DAVID 在線數據庫對mRNA進行GO和KEGG分析。對靶基因參與的生物學過程、細胞成分、分子功能和信號通路進行富集分類。P<0.05被認為有統計學意義。

1.8 TF-miRNA-mRNA互作網絡構建

利用Cytoscape3.2.0軟件，根據預測的靶向結合關系，將轉錄因子、靶基因和miR-148a-3p的結合作用繪制成功能關系網絡圖。

1.9 數據分析

熒光定量數據采用2-△△CT法計算基因的表達情況。利用Graphpad Prism進行差異性統計分析。其中認為P<0.05表現為差異顯著。

2 結 果

2.1 小鼠不同組織中miR-148a-3p的表達

qRT-PCR結果表明，miR-148a-3p在腎、心、肝、皮膚、脾、胃、肺等組織中均有表達。miR-148a-3p的豐度與U6 snRNA的豐度進行了歸一化。其中，miR-148a-3p在脾中的表達水平最高(P<0.001)，肝次之(P<0.001)，在皮膚、胃、心、腎、肺中的表達水平逐漸降低(圖1)。

2.2 miR-148a-3的TFBS預測

通過Promoter Scan Version和TRANSFAC兩個在線數據庫對miR-148a-3p前體上游的TFBS進行預測，在啟動子區域檢測到多個基因可以作用于miR-148a-3p前體，例如DNA聚合酶β結合蛋白(BATA-pol)、CAMP反應元件結合蛋白(CREB)、E1A調節的轉錄因子(E4F1)核因子S(NF-S)、激活增強子結合蛋白2α(AP-2)和轉錄因子IID(TFIID)等。

2.3 miR-148a-3p的保守性分析

通過比較獼猴、大猩猩、人、牛、泛穴居人、褐家鼠、小鼠、山羊、家犬共9個物種的miR-148a-3p成熟體序列，發現miR-148a-3p高度保守(表1)，成熟miRNAs具有相似的序列和相同的種子區(CAGUGCA)。

2.4 miR-148a-3p靶基因預測

將TargetScan、PicTar和miRanda預測出的miR-148a-3p的靶基因取交集，共得到25個交集靶基因(圖2)。再結合miRwalk數據庫中已證實的23個基因和已證實發表的15個基因，共得到63個miR-148a-3p的靶基因，用于GO富集和KEGG通路富集分析(表2)。

2.5 miR-148a-3p靶基因的GO富集分析

GO富集分析表明，miR-148a-3p的靶基因集中在離子轉運、膜電位調節、心發育、細胞對膽固醇的應答和對有機物的應答等多種生物學過程中。主要的分子功能是乙酰膽堿激活的陽離子選擇通道活性、乙酰膽堿結合活性和乙酰膽堿受體活性，且這些靶基因主要在細胞質和質膜上發揮作用(圖3)。

***. P<0.001圖1 miR-148a-3p在不同組織中的表達情況Fig.1 The miR-148a-3p expression in different tissues

表1 miR-148a在不同物種中的序列

2.6 miR-148a-3p靶基因的KEGG通路富集分析

KEGG途徑富集分析提供了miR-148a-3p靶基因所參與的信號轉導通路。結果表明，miR-148a-3p靶基因主要富集在TGF-β、肥厚性心肌病和黏附連接等信號通路中(圖4)。

2.7 TF-miRNA-mRNA互作網絡

轉錄因子ATF、CREB、NF-S、bata-pol和E4F1與miR-148a-3p及其靶基因形成了一個復雜的網絡。涉及70個點和70條邊，包含5個轉錄因子和63個mRNAs。從網絡圖中可以直觀地看出miR-148a-3p通過調控靶基因(FMRP、Nrp1、BRCA1、p27等)參與了肥厚性心肌病途徑、黏附連接通路和內質網加工等許多信號轉導途徑(圖5)。

3 討 論

miRNA家族是基因表達調控網絡的重要組成部分，參與調節細胞代謝、細胞遷移和血管生成的許多重要信號通路[15]。目前，有關 miR-148a-3p的研究主要中在其抗增殖潛能[16-19]以及誘導細胞周期停滯[20]、分化[21]、凋亡[22]等重大生命進程方面。

A.3個數據庫的韋恩圖；B. 3個數據庫分別對應的基因數統計圖；C. 韋恩圖中3個部分：不相交的，兩兩相交的和三個相交的基因數量A.Venn diagram of 3 databases; B. The statistics of the number of genes corresponding to the 3 databases; C. Three parts in the Venn diagram: genes number of disjoint, pairwise intersecting and three intersecting圖2 預測的miR-148a-3p靶基因的三重維恩圖及直方圖Fig.2 Ternary Venn diagram and the histogram of miR-148a-3p predicted target genes

表2 miR-148a-3p靶基因的統計

Liu和Sun等[23]研究發現，miR-148a-3p可以通過破壞p300依賴的Nrf2通路激活來阻止成骨細胞分化和骨重塑。Wu等[24]研究發現，miR-148a-3p可以上調AGO1的表達，繼而參與調節轉化生長因子-β (TGF-β)途徑促進卵巢癌進展。大腸癌中腫瘤細胞表面主要組織相容性復合體I類(MHC-I)的低表達是腫瘤逃避T細胞識別的機制之一，而抑制miR-148a-3p的表達可以恢復MHC-I的水平，并顯著增強CD8+T細胞介導的免疫攻擊作用[25]。這些研究都證明了miR-148a-3p與mRNA互作網絡在腫瘤中可以參與不同的信號通路，發揮不同的生理作用。本試驗分析還發現，miR-148a-3p可以參與蛋白呈遞、黏附連接通路和蛋白泛素化等通路，這些都是維持細胞正常生長的基礎通路。

此外，已有研究表明 miR-148a-3p在人體各種組織中表達，如心、肝、胎盤和睪丸，在正常生理條件下miR-148a-3p在造血系統中也有表達[26-27]，這與本研究結果相似。本試驗qRT-PCR結果表明，miR-148a-3p在小鼠的肝、心、皮膚、腎、胃、脾、肺組織中均有表達，而在脾中的表達要明顯高于其他組織。眾所周知，脾是血循環中重要的過濾器，能清除血液中的異物、病菌以及衰老死亡的細胞[28]。脾中的免疫細胞可以產生免疫球蛋白、補體等免疫物質，發揮免疫作用，有助于對抗某些引起肺炎和腦膜炎的細菌[29]。機體發生腫瘤的主要原因為免疫系統監控失調，而脾作為人體免疫系統的重要組成部分，無疑與腫瘤的發生密切相關[30]。因此，維持miR-148a-3p在脾中的穩定表達，對于維持機體免疫系統保持恒定水平具有重要意義。推測，miR-148a-3p可能是參與脾正常功能維持的重要調節因子，深入研究miR-148a-3p在脾中的作用對治療人類疾病具有重要意義。

圖3 miR-148a-3p靶基因GO分析Fig.3 GO enrichment analysis of miR-148a-3p predicted target genes

圖4 miR-148a-3p靶基因KEGG通路分析Fig.4 The KEGG pathway analysis of miR-148a-3p target genes

圖5 TF-miRNA-mRNA互作網絡圖Fig.5 TF-miRNA-mRNA interacting pathway network

轉錄因子、miR-148a-3p和靶基因的互作形成了一個全面的調控網絡，控制著機體正常的生命活動，任何一環的失調都可能導致疾病，甚至癌癥的發生。其中P27是一種抑癌基因，為細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子[31-33]。研究表明，晚期胃癌患者miR-148a-3p的表達偏高，其下游靶基因P27嚴重失調，這可能是胃癌細胞惡化的一個重要因素[34]。miR-148a-3p還可以與Smad2的3′UTR結合并抑制其活性，激活轉化生長因子TGF-β/SMAD2途徑，抑制細胞遷移、侵襲、生長和存活[35]。PTEN作為抑癌基因，可通過去磷酸化參與細胞調控[36-40]。在黑色素瘤中，miR-148a-3p可以靶向抑癌基因PTEN，負向調控PTEN的表達，從而促進黑色素瘤細胞的生長和遷移，并抑制其凋亡[41]。DNA損傷誘導蛋白GADD45A下調是膠質瘤預后差的一個主要原因，miR-148a-3p可以通過下調GADD45A促進膠質瘤細胞侵襲和腫瘤發生。本試驗預測的互作網絡中涉及5個轉錄因子和63個mRNAs，這些mRNA參與了細胞周期、信號轉導、蛋白轉運等一系列進程，部分互作已被證實，但還有許多預測結合的mRNA未被試驗證實。

4 結 論

本研究顯示，miR-148a-3p在小鼠脾組織中高表達且受E4F1、ATF、NF-S等多種轉錄因子的調控，并調控Smad2、GADD45A、P27、PTEN等靶基因。這些靶基因通過多種生物學途徑影響細胞的增殖、分化和代謝，調節和維持生物體的相對穩定狀態。推測miR-148a-3p在維持細胞正常生長的基礎通路和癌癥的發生中發揮重要作用。