四川盆地6個地方雞群體遺傳關系研究

尤桂爽，易興友，蔣美山，李中偉，譚和林，曹 池，舒 剛，田堯夫，朱 慶，趙小玲*

(1．四川農業(yè)大學動物科技學院，成都 611130； 2．重慶市開州區(qū)農業(yè)發(fā)展服務中心，重慶 405499)

四川盆地由中國西部橫斷山脈、云貴高原、大巴山、武夷山環(huán)繞形成，盆地北部大巴山橫直在萬源宣漢北部，明月山、銅鑼山、華釜山由北而南縱臥其間，自然分割形成盆地和丘陵地貌。海拔跨度極大的地勢造就了豐富的生物多樣性，形成了包括國家畜禽遺傳資源舊院黑雞、城口山地雞、大寧河雞等在內的家禽品種[1]。在大巴山脈與長江山峽的交界處，有1個新的家禽品種巖水雞，其體態(tài)輕盈，羽色為純黑或純白，目前處于地方畜牧部門保護開發(fā)的計劃中。南部地區(qū)武夷山和云貴高原的交匯點也有顯著的海拔變化，分布著沐川烏骨雞、豐巖烏骨雞等家禽品種[2]。

城口山地雞地處重慶市城口縣，為肉蛋兼用型品種，羽色純黑，黑膚、烏肉，肉質細嫩，深受當地人民的喜愛。舊院黑雞主產于四川省萬源市舊院鎮(zhèn)，是肉蛋兼用型品種，外觀與城口山地雞近似，羽色純黑，黑膚、烏肉，肉質鮮美[3]。大寧河雞產于重慶市巫溪縣，屬兼用型地方品種，公雞紅羽，母雞黃麻羽。巖水雞白羽和黑羽群體產于重慶開州區(qū)，北鄰城口東鄰巫溪，是出名的高寒山區(qū)，該品種環(huán)境適應性強，肉蛋兼用[4]。豐巖烏骨雞羽毛、皮、骨、肉俱黑，產于四川瀘州敘永縣，已有300年以上歷史，長期以來當地苗、漢農民就養(yǎng)殖烏骨雞饋贈親友，配以中草藥滋補療疾。

近年來隨著經濟的發(fā)展，交通的便利，出現(xiàn)了相鄰地域品種混雜，毛色不純，膚色變淺等問題，根據農業(yè)部的報告，一些地方雞種的種群數量一直在迅速減少甚至瀕臨滅絕[5]。第三次全國畜禽遺傳資源普查品種鑒定工作正在開展，為說明四川及其臨近區(qū)域品種間遺傳多樣性，便于后續(xù)的品種保護和開發(fā)利用[6]，本研究采用簡化基因組開展了6個地方雞群體的遺傳研究。簡化基因組測序技術(genotyping-by-sequencing，GBS)是在二代測序基礎上發(fā)展起來的[7]，通過酶切加標簽的方法測序獲得酶切位點附近基因序列信息，進而檢測大量高準確性的SNP變異位點信息，可了解種質資源的遺傳背景和系統(tǒng)演化，研究群體親緣關系及種群結構[8]。Pértille等[9]用GBS法對462只雞進行測序，鑒定出67 096個SNPs，全基因組覆蓋率為4.66%。豬群測序檢測到假定的SNPs，平均密度為每10 kb有0.33個SNPs[10]。此外，在一項牛研究中還鑒定出63 797個SNPs[11]。GBS是一種經濟高效的方法，已成功地應用于群體遺傳學研究[12-14]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用了來自5個保種場的6個地方品種雞，每個品種選取20個個體(10公、10母)共120只，150～250日齡，分別為城口山地雞、大寧河雞、舊院黑雞、豐巖烏骨雞、巖水雞黑羽和巖水雞白羽，采樣信息見表1。將樣本進行翅下靜脈采血，并保存于-20 ℃。使用標準的苯酚/氯仿方法從全血中提取基因組DNA。用分光光度計(德國埃普多夫公司)定量DNA濃度，并將樣品稀釋至最終濃度100 ng·μL-1[15]。

表1 地方雞群體采樣信息

1.2 試驗方法

1.2.1 簡化基因組測序和SNP 鑒定 DNA樣品送往廣州基迪奧生物科技有限公司利用Gallusgallus基因組(GenBank登錄號：GCF_000002315.6)作為參考基因組，用GBS技術構建測序文庫，采用限制性內切酶CTGCAG(PstⅠ) + CATG(NlaⅢ)對DNA進行酶切，連接回收后對片段使用高保真酶進行PCR擴增，測定PCR產物濃度后將混好的文庫上機測序(Illumina HiSeqTM 2500)。

高通量測序得到的原始圖像數據文件經堿基識別轉化為原始測序序列，過濾后使用比對軟件BWA(0.7.12)采用mem算法后將過濾后的reads比對到參考基因組上，比對參數為-k 32 -M；比對完之后結果使用PICARD(版本1.129)軟件進行標記[16]。使用變異檢測軟件GATK(版本3.4-46)進行群體SNP檢測，然后使用ANNOVAR(版本2)對檢測出的突變位點進行功能注釋。

1.2.2 遺傳數據分析 用Perl編程計算觀測雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)、多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC)、觀測等位基因數(number of observed alleles，Na)、有效等位基因數(number of effective alleles，Ne)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，Pi)、遺傳分化系數(F-statistic，F(xiàn)st)、遺傳距離(genetic distance，DR)及基因流(gene flow，Nm)。利用軟件GCTA(Version 1.25.0)進行主成分分析(principle component analysis，PCA)，采用鄰接法(neighbor-joining method)構建系統(tǒng)發(fā)生樹，通過Treebest軟件計算距離矩陣，系統(tǒng)發(fā)生樹的可靠性通過Boot-strap法進行檢驗。使用Admixture軟件(v1.3)[17]進行群體結構的推斷，分別假設樣品的分群數(K值)為1～9， 然后進行聚類，根據交叉驗證錯誤率來確定最優(yōu)分群數。

2 結 果

2.1 6個地方雞群體的基因組SNPs鑒定

2.1.1 測序質量 120個地方雞樣本，剔除2個核酸質量低的樣本，通過GBS測序，剩余118個樣本測序質量較高(Q20≥97.58%、所有樣品的平均測序深度為20×，平均覆蓋度為6.48%)。經過篩選過濾后，118個樣品共獲得291 359個高質量的SNPs位點。Q30≥92.74%，GC分布正常，群體樣本與參考基因組的平均比對率為99.33%。

2.1.2 突變篩選 去除等位基因數大于2、缺失數據大于50%、次要等位基因頻率小于5%、雜合度大于80%的標記(SNPs/Indels)，保留271 672個SNPs和19 687個Indels，用于群體遺傳分析。

2.2 6個地方雞群體的遺傳多樣性分析

6個群體的核酸多態(tài)性范圍為6.71×10-5(巖水雞黑羽)～8.58×10-5(大寧河雞)；觀測雜合度范圍為0.133(巖水白羽雞)～0.168(城口山地雞)；期望雜合度范圍為0.154(巖水黑羽雞) ～0.197(大寧河雞)；多態(tài)信息含量范圍為0.125(巖水黑羽雞)～0.162(大寧河雞)，屬低度多態(tài)性(PIC<0.25)；觀測等位基因數范圍為1.534(巖水雞黑羽)～1.750(城口山地雞)；有效等位基因數范圍為1.256(巖水雞黑羽)～1.318(大寧河雞)(表2)。整體上大寧河雞和城口山地雞的遺傳多樣性較高，巖水雞黑羽和巖水雞白羽的遺傳多樣性較低。

表2 6個雞群體遺傳多樣性參數

2.3 6個地方雞群體的遺傳分化系數和遺傳距離

6個群體間兩兩遺傳分化系數(Fst)范圍為0.053～0.183，遺傳距離(DR)為0.087～0.119，基因流(Nm)為1.12～4.50。巖水雞黑羽與大寧河雞、舊院黑雞、豐巖烏骨雞，巖水雞白羽與豐巖烏骨雞的遺傳分化較大(0.15≤Fst≤0.25)，其余品種之間的遺傳分化中等(0.05≤Fst≤0.15)。群體間遺傳分化最大的是豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽群體(Fst=0.183)，最小的是城口山地雞和大寧河雞(Fst=0.053)。群體間遺傳距離最近的是巖水雞黑羽和白羽群體(DR=0.087)，遺傳距離最遠的是大寧河雞和巖水雞白羽群體(DR=0.119)。群體間基因流動最大的是大寧河雞和城口山地雞(Nm=4.05)，流動最小的是巖水雞黑羽和豐巖烏骨雞(Nm=1.12)(表3和表4)。

表3 6個群體間的遺傳分化系數(Fst)和遺傳距離(DR)

表4 6個群體的基因流

2.4 6個地方雞群體遺傳結構分析

2.4.1 主成分分析 對獲得的SNPs標記進行主成分分析，結果表明3個主成分變異貢獻率分別為7.31%、4.31%和4.04%(圖1)。由圖1可以看出，城口山地雞、大寧河雞、舊院黑雞形成一個緊密的類群，豐巖烏骨雞、巖水雞白羽和黑羽相對獨立，并且豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽群體相對集中，巖水雞白羽群體相對分散。

2.4.2 系統(tǒng)發(fā)生樹分析 根據地方雞6個群體的系統(tǒng)發(fā)生樹可以明顯看出(圖2)，城口山地雞、大寧河雞、舊院黑雞和豐巖烏骨雞各自聚為一類，巖水雞白羽和黑羽聚為一類。

圖1 地方雞6個群體的主成分分析Fig.1 Principal components analysis of 6 local chicken populations

圖2 地方雞6個群體的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Phylogenetic tree of 6 local chicken populations

2.5 6個地方雞群體遺傳結構分析

預設群體分群數從2到9，通過Admixture軟件分析地方雞的群體結構，根據交叉驗證錯誤率的谷值確定最優(yōu)分群數(K)。如圖3所示，當K=5時交叉驗證錯誤率最低，說明本研究分析的樣品最大概率來自于5個原始的祖先。圖4展示了6個群體的遺傳結構。當K=2和3時，巖水雞黑羽和白羽明顯具有和其它品種不同的來源。在K=4時，豐巖烏骨雞與巖水雞黑羽遺傳結構差異大，而城口山地雞、大寧河雞、舊院黑雞遺傳結構近似。在K=5時，大寧河雞、舊院黑雞、豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽遺傳差異明顯，城口山地雞和巖水雞白羽呈現(xiàn)出部分血液混雜，K=6～9呈現(xiàn)出更詳細的品種遺傳信息。

圖3 交叉驗證錯誤率Fig.3 Cross validation error rate

3 討 論

對品種內多樣性和物種種群結構的了解是改進品種選擇計劃、了解群體環(huán)境適應性和政府實施種群保護計劃的基礎[18-19]。雖然大多數群體遺傳結構研究都針對世界性的商用品種，但人們對地方品種的遺傳學關系越來越感興趣，因為它們可以從根本上理清品種的內在關系[20]。

本試驗利用簡化基因組研究了四川盆地周邊山脈6個地方雞種的基因組多態(tài)性。期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)是衡量標記多態(tài)性較好的指標[21-22]。6個地方雞品種的He范圍為0.154～0.197，平均期望雜合度和Cendron等[23]用全基因組測序分析意大利地方品種雞的結果相似。6個地方雞品種的PIC范圍為0.125～ 0.162，為低度多態(tài)性(PIC<0.25低度多態(tài)性；0.250.5高度多態(tài)性)[24]。本研究中PIC含量結果低于微衛(wèi)星的結果[25]，這是由于標記類型之間的差異。由于SNP的雙等位特性，簡化基因組的PIC在0～0.5之間，而對于多等位的微衛(wèi)星標記，PIC在0～1.0之間，由于前者的PIC較低，因此需要比微衛(wèi)星更多的SNPs才能獲得相同的排斥力[26]。Abdalhag等[27]也檢測到類似的低PIC值。在這6個地方品種中，巖水雞黑羽和巖水雞白羽群體的雜合度較低，6個種群遺傳多態(tài)性最高的是大寧河雞，最低的是巖水雞白羽和黑羽群體，其原因是大寧河雞的群體數量較大且分布的范圍較廣，而巖水雞白羽和黑羽群體可能由于保種群體小，存在遺傳漂變，并局限在一個較為封閉的高山環(huán)境中，與其它群體之間基因交流的機會少。從基因流也可以看出，這兩個群體同其它4個群體的基因流動值最小，因此該品種具有一定的遺傳獨特性，這突顯了保護這些品種生物多樣性的難度，因此必須特別注意這些品種的保護，可以采用各家系等量留種的保種方式，盡量保持現(xiàn)有等位基因，防止近交衰退[28]。大寧河雞的遺傳多樣性較為豐富，其保種效果較好。

圖4 6個地方雞品種的結構聚類分析Fig.4 Structure clustering of 6 local chicken populations

為了解這6個地方品種之間的遺傳關系和群體結構，本研究計算了群體的遺傳分化指數(Fst)和遺傳距離(DR)的成對估計，并進行了主成分、系統(tǒng)發(fā)生樹和Structure分析。Fst揭示了種群間的遺傳分化程度，本試驗中城口山地雞和大寧河雞間分化中等，舊院黑雞和豐巖烏骨雞間分化較大[29-30]。前人的研究表明，印度[31]、中國[32]和非洲本土雞群[33]的Fst值較高(0.15到0.26)，而Rashid等[34]報告了孟加拉國5個地方雞種的Fst在0.084～0.154之間。Hassen等[35]報告了埃塞俄比亞西北部7個土生雞種群的地理距離從0.073到0.13。Seo等[36]發(fā)現(xiàn)5個韓國本土雞之間的成對遺傳距離為0.083～0.171。本研究結果與上述3個研究結果相似，遺傳距離值較小。此外，Yamamoto[37]的研究報告了孟加拉土雞不同群體之間的遺傳分化程度較低。總體而言，四川盆地地方雞群體間的遺傳分化程度較低，這可能是由于它們之間以及構建群體的共同祖先之間的基因流動所致。本研究中Fst和基因流都顯示城口山地雞和大寧河雞群體間的分化程度最小，豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽群體間的分化最大。系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，巖水雞白羽和巖水雞黑羽聚為一類，與基因流結果一致。利用Structure程序對中國地方6個雞群的遺傳結構進行了研究，當K=5時，交叉驗證錯誤率最低，說明本研究分析的樣品應該是來自于5個原始的祖先。結構數據還表明，在每個群體中有一定比例的遺傳混合來自其他品種，鄰近地區(qū)或種群可能存在一定的基因流動。同時結構數據表明，豐巖烏骨雞和舊院黑雞被明顯分離開，這與主成分分析和系統(tǒng)發(fā)生樹的結果一致。前人研究認為，兩個品種間的遺傳相似系數為0.795，二者親緣關系較近[38]。檢測方法不同可能導致了結果差異[39]。本研究結果還表明，巖水雞白羽處于系統(tǒng)發(fā)生樹的最遠分支，與本研究其他地方雞種相比存在明顯的遺傳差異。這在主成分、Fst和基于模型的聚類結果中均有體現(xiàn)。這個聚類結果與各品種在四川盆地的分布區(qū)域基本吻合, 說明四川地方雞品種的形成與地理環(huán)境存在很大的關系[40]。

4 結 論

本研究應用簡化基因組對四川盆地的6個地方雞品種進行分析，結果發(fā)現(xiàn)巖水雞黑羽群體的遺傳多樣性較低，大寧河雞遺傳多樣性最為豐富。城口山地雞和大寧河雞之間的遺傳分化最低，基因流最高，豐巖烏骨雞和巖水雞黑羽群體之間的遺傳分化最高，對應的基因流最低。巖水雞白羽群體和黑羽群體聚為一類，城口山地雞、大寧河雞和舊院黑雞聚為一類，豐巖烏骨雞單獨為一類。位于烏蒙山區(qū)的豐巖烏骨雞與大巴山脈的舊院黑雞、城口山地雞、大寧河雞、巖水雞黑羽和白羽具有較遠的遺傳距離。