膀胱癌患者血清miR-21、miR-119a表達量與腫瘤惡性增殖及侵襲的相關性分析

吳德柱，李清林，彭 娜，林建峰

膀胱癌是泌尿系統最為常見的腫瘤疾病，近年來膀胱癌發病率及病死率較高，且呈逐漸增長的趨勢[1]，嚴重危害患者的生命健康。有研究顯示[2]，膀胱癌的發病率會隨年齡增長而上升，且男性發病率高于女性。目前，多種療法對膀胱癌具有顯著的臨床效果[3-4]，保障了患者生命健康，但膀胱癌細胞具有很高的增殖能力和侵襲能力，臨床診治中并不能完全根治所有患者，有些患者甚至在術后有復發的可能性。因此開展膀胱癌相關分子機制研究以尋求有效診斷及評估腫瘤惡性特征的生物標志物對膀胱癌的早期檢測、早期治療及預后具有重要的意義。微小核糖核酸（MicroRNAs,miRNAs）是一類進化上保守的非編碼小分子RNA，具有在翻譯水平調控基因表達的功能，研究顯示多種miRNAs 與腫瘤抑制或致癌功能具有密切聯系[5]，而膀胱癌患者中可見血清miR-21和miR-119a異常表達。許多學者研究發現，miRNA 的表達量與癌癥患者的性別、年齡之間并無明顯的相關性[6-7]。因此本研究旨在觀察血清miR-21和miR-119a是否可以預測膀胱腫瘤并分析其與腫瘤惡性增殖及侵襲的關系，以期為臨床膀胱癌的早期診斷與治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料 膀胱癌患者及健康體檢者各48例，分為膀胱癌組和正常對照組。膀胱癌組平均年齡（59.54±10.17）歲，男女比例為22/26；正常對照組平均年齡（59.27±8.71）歲，男女比例為22/26，兩組年齡、性別等臨床資料分布具有可比性，差異無統計意義（P>0.05）。納入標準：①膀胱癌符合膀胱癌診斷標準[8]；②所有受試者知情研究內容，表示愿意配合研究工作并簽署知情同意書。排除標準：①合并其他腫瘤疾病患者；②合并其他泌尿系統疾病患者；③近期內行放療、化療等治療措施者；④急危重癥疾病化患者；⑤精神疾病者，妊娠期者。本研究經醫院倫理委員會審核批準（倫理號：YXLL20170201），符合倫理道德要求。

1.2 實驗材料 試劑miR-21，miR-119a 檢測試劑盒、TMM 試劑盒購于北京奧維亞生物技術有限公司；蛋白裂解液及二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司，第10 號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白（tension of the protein，PTEN）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、細胞周期蛋白D1（cell cycle egg D1，CyclinD1）、轉化生長因子-β（transforming growth factor -β，TGF-β）、β-連環蛋白（Beta-catenin，β-catenin）、N-鈣黏蛋白（Ncadherin）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）一抗均購自美國Abcam 公司，β-catin 一抗購于北京索萊寶公司，MBR-506D 冰箱購自日本三洋有限公司，PCR 儀購自美國默賽飛公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光定量PCR 檢測miR-21、miR-119a 表達量 抽取所有受試者清晨靜脈血5 mL，離心后收集上清液，用Trizol 試劑提取和收集總RNA，采用熒光定量PCR 檢測血清miR-21、miR-119a 表達量。取行膀胱癌根治術的膀胱癌患者膀胱組織和癌旁正常組織（距癌組織5 cm 處）放入研磨器中，加入液氮粉碎并研磨，利用組織裂解液裂解組織，用Trizol 試劑提取和收集總RNA，采用熒光定量PCR檢測組織miR-21、miR-119a表達量。熒光定量PCR操作方法如下：對目標RNA 逆轉錄后，設置PCR 反應條件:95 ℃預變性30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，重復40 個循環實施擴增反應，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s 制備溶解曲線，以β-actin 作為內部參考，采用2-ΔΔCt方法計算miR-21、miR-119a 的相對表達量。相關引物見表1。

表1 引物名稱及相關序列

1.3.2 蛋白質印跡法（Western Blot，WB）檢測相關蛋白表達量 取行膀胱癌根治術的膀胱癌患者膀胱組織和癌旁正常組織（距癌組織5 cm 處）放入研磨器中，加入液氮粉碎并研磨，利用組織裂解液裂解組織，提取組織液總蛋白，采用BCA 法行蛋白定量。在120 V 電壓條件下持續電泳至樣品到達凝膠底部，半干轉膜儀轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，洗膜后剪下相應條帶，分別加入GAPDH、PTEN、PI3K、AKT、CyclinD1、TGF-β、β-catenin、Ncadherin、E-cadherin 一抗，在4 ℃下孵育過夜。次日取出PVDF 膜，用洗膜緩沖液（TBST）洗脫3 次，再加入二抗反應液，置于搖床上搖動，洗脫3 次。使用ECL溶液顯色，自動電泳凝膠成像分析儀采集圖像，以目的蛋白與GAPDH 的吸光度比值表示相對蛋白表達量。

1.3.3 提取細胞 取受試者新鮮組織標本，剪碎，用1%的胰酶消化，孵育30 min后加入血清終止反應。用移液管反復吹打，用70 μm 孔徑的細胞篩過濾，除掉大塊沒消化的團塊。得到的濾過液離心后，沉淀物培養。然后采用分選型流式細胞儀提取細胞。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡能力 收集細胞，采用PBS 洗滌，用蛋白酶消化液懸浮細胞，300 r/min離心10 min后在室溫下加入5 μL的PI染色液，5 min后PBS洗滌，流式儀檢測細胞凋亡率。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞周期 收集細胞，PBS緩沖液沖洗后分別加入胰蛋白酶消化5 min，離心后加入冰預冷的70%的乙醇固定(4 ℃) 過夜(破膜)。每瓶加入500 μL PI染液后，于低溫(4 ℃)孵育箱中孵育30 min，然后進行檢測。結果用細胞周期擬和軟件分析凋亡細胞所占百分率。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示。兩組均值比較采用兩獨立樣本t檢驗，雙變量相關采用Pearson 相關分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者血清miR-21 和miR-119a 表達水平 膀胱癌組血清miR-21 和miR-119a 相對表達量均高于正常對照組（均P<0.05）。圖1。

圖1 受試者血清miR-21和miR-119a相對表達量比較

2.2 ROC 曲線分析血清miR-21 和miR-119a 預測膀胱癌診斷價值 血清miR-21 和miR-119a 相對表達量以約登指數最大的cut-off為臨界點，確定最佳臨界值分別為1.08和1.15時，相對應的曲線下面積為0.995（0.986 - 1.000，P<0.05）和0.996（0.990 -1.000，P<0.05），血清miR-21 和miR-119a 預測膀胱癌具有良好的診斷價值。圖2。

圖2 ROC曲線分析血清miR-21和miR-119a預測膀胱癌結果

2.3 膀胱癌組織和癌旁正常組織miR-21 和miR-119a 表達水平 與癌旁正常組織比較，膀胱癌組織miR-21和miR-119a相對表達量均升高（均P<0.05），圖3。

圖3 膀胱癌組織和正常組織miR-21和miR-119相對表達量比較

2.4 膀胱癌組織和癌旁正常組織相關增殖基因表達水平 與癌旁正常組織比較，膀胱癌組織PTEN相對表達量降低（均P<0.05），PI3K、AKT、CyclinD1相對表達量均升高（均P<0.05）。圖4。

圖4 膀胱癌組織和正常組織相關增殖基因表達水平比較

2.5 膀胱癌組織和正常組織相關侵襲基因表達水平 與癌旁正常組織比較，膀胱癌組織E-cadherin相對表達量降低（均P<0.05），TGF-β、β-catenin、Ncadherin相對表達量均升高（均P<0.05）。圖6、圖7。

圖5 膀胱癌組織和正常組織相關侵襲基因表達水平比較

2.6 細胞凋亡率 與膀胱癌正常組織比較，膀胱癌組織凋亡率較低，P<0.05。圖6。

圖6 膀胱癌組織和正常組織凋亡率比較

2.7 細胞周期 與膀胱癌正常組織比較,膀胱癌組織G1期的比例低于膀胱癌正常組織，S、G2期的比例則高于膀胱癌正常組織，P<0.05。圖7。

圖7 膀胱癌組織和正常組織周期分布比較

2.8 血清miR-21和miR-119a與癌組織增殖基因及侵襲基因相關性分析 Pearson相關分析顯示，血清miR-21 和miR-119a 表達水平與PI3K、AKT、Cy‐clinD1、TGF-β、β-catenin 及N-cadherin 表達呈正相關（均P<0.05），與PTEN 和E-cadherin 表達呈負相關（均P<0.05），表2。

表2 Pearson相關性分析統計值

3 討論

膀胱癌早期臨床癥狀并不明顯，確診時癌癥已經發展為中晚期，無疑增加臨床治療難度，而且治療中晚期膀胱癌往往整體預后情況較差。此外，膀胱癌的惡性程度決定了患者預后效果，但目前臨床常用的評估癌癥惡性程度的方法是通過穿刺活檢或手術取癌組織進行檢測，此種方法不能多次獲取，且不利于疾病病情的動態評估，而血清學指標避免了以上局限性，因此開展膀胱癌相關分子機制研究以尋求有效診斷及評估腫瘤惡性特征的血清學標志物對膀胱癌的早期檢測、早期治療及預后具有重要的意義。

miR-21 位于位于染色體17 (17q.23.1)上，其有高度保守的啟動子，并且通過調控多種靶基因而參與多種腫瘤疾病的發生。研究發現miR-21 靶向作用于TET1 促進結直腸癌細胞增殖、侵襲及遷移[9]；miR-21 調控程序性細胞死亡4 基因的表達而抑制宮頸癌細胞增殖和侵襲能力[10]；miR-21 調控人唾液富組蛋白1可抑制肺癌細胞遷移和侵襲[11]。基于以上研究發現，miR-21通過靶向作用多種蛋白而影響腫瘤增殖、遷移、侵襲等作用。本研究發現，膀胱癌患者血清miR-21 表達水平明顯高于正常人，膀胱癌組織miR-21 表達水平明顯高于癌旁組織，提示miR-21過表達與膀胱癌的發生發展密切相關，多項研究表明miR-21 表達與膀胱癌進展和預后相關[12-14]。miR-119a 是一種存在于第19 號位染色體上的核糖核酸，研究顯示miR-119a 在膀胱癌組織中表達量顯著上升，上調miR-119a 可能與靶向抑制脆性組胺三聯體蛋白的表達來促進膀胱腫瘤細胞增殖與遷移效應有關[15]。與上述研究結果一致，本研究膀胱癌組織miR-119a 表達水平高于癌旁正常組織，而且膀胱癌患者血清miR-119a 表達水平明顯高于正常人，提示miR-119a 參與膀胱癌生物學作用。通過分析膀胱癌組織miRNAs 表達量與血清表達量的關系，發現膀胱癌患者血清miR-21和miR-119a 表達水平與其癌組織miR-21 和miR-119a 表達水平表達趨勢一致，兩者呈正向相關，結果表明了檢測膀胱癌患者血清miR-21 和miR-119a表達水平可間接反映出癌組織miR-21 和miR-119a表達水平。鑒于膀胱癌患者與正常人miR-21 和miR-119a 表達量差異較大，本研究進一步進行ROC 曲線分析，評估血清miR-21 和miR-119a 預測膀胱癌診斷價值，ROC曲線分析結果顯示，兩者曲線下面積均大于0.8，說明血清miR-21 和miR-119a 預測膀胱癌具有較高的診斷價值，提示血清miR-21、miR-119a可能是膀胱癌的潛在生物標志物。

目前未有研究明確指出血清miR-21 和miR-119a 與膀胱癌增殖、侵襲等惡性特征有直接聯系，因此本研究對血清miR-21和miR-119a表達量與膀胱癌增殖、侵襲的關系進行探索。已有研究顯示，PTEN、PI3K、AKT 和CyclinD1 蛋白可用于細胞增殖評估，TGF-β、β-catenin、N-cadherin 和E-cadherin 蛋白可用于細胞發生侵襲評估[16]。PTEN 普遍被認為是抑癌基因，在抑制多種惡性腫瘤發生中扮演著重要的角色，PTEN 能夠抑制PI3K/AKT 信號通路活化，致使PI3K和AKT蛋白發生去磷酸化，導致信號轉導活性降低無法啟動下游cyclinD1 等基因的表達[17-18]，進而影響膀胱癌細胞增殖作用[19]。本研究結果顯示，膀胱癌組織PI3K、AKT 和CyclinD1 蛋白表達量較癌旁正常組升高，而PTEN 蛋白表達量降低，以上結果在其他研究中得以證實[20-21]。實驗結果表明PTEN蛋白表達降低，PI3K、AKT和CyclinD1蛋白表達升高可促進癌細胞增殖。癌細胞發生上皮間質轉化的過程中，TGF-β1是重要的誘導因子，通過細胞內β-catenin 進行信號轉導能夠增加間質標志基因N-cadherin、增強細胞的運動性能[22-23]，癌細胞侵襲作用與上述分子表達高度相關，在研究結果中，膀胱癌組織TGF-β、β-catenin和N-cadherin蛋白表達量較癌旁正常組升高，而E-cadherin蛋白表達量降低，結果提示E-cadherin蛋白低表達，而TGF-β、β-catenin 和N-cadherin 蛋白高表達利用癌細胞侵襲。Pearson 相關分析結果顯示，血清miR-21 和miR-119a 表達平與PI3K、AKT、CyclinD1、TGF-β、β-catenin 及N-cadherin 表達呈正相關，與PTEN 和E-cadherin 表達呈負相關，結果表明血清miR-21 和miR-119a表達水平與膀胱癌增殖、侵襲等惡性特征具有一定的聯系。進一步研究發現，與低miR-21和miR-119a 表達組別比較，高miR-21 和miR-119a表達量的膀胱癌TGF-β、β-catenin、N-cadherin 的蛋白表達量較高，這說明miR-21 和miR-119a 的表達異常和癌細胞侵襲具有密切關聯。張棟邦等[24]和何鵬等[25]也證實了這一結論。

綜上所述，膀胱癌患者血清miR-21和miR-119a表達水平異常升高，血清中miR-21 和miR-119a 的表達水平對膀胱癌的預測具有較高的價值，并且兩者表達量與相關增殖基因和侵襲基因表達高度相關，提示血清miR-21 和miR-119a 表達水平可能是膀胱癌的潛在生物標志物，對膀胱癌的發生發展及增殖、侵襲等具有重要意義。