還原型谷胱甘肽調控Nrf2/iNOS信號對DR大鼠視網膜的保護機制

楊馥宇，蘇 杰，王 玲，王林洪，張 蒙

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的一種微血管并發癥，是最常見的并發癥，也是全球主要的致盲性眼病[1-2]，其主要以視網膜血管改變為病理特征，眼底多表現為視網膜滲出水腫、新生血管、視物模糊、視力下降、出血及增殖膜形成等，如未能得到及時有效的治療，會嚴重威脅患者的視覺健康[3]。谷胱甘肽是生物體內抗氧化防御系統中最重要的小分子活性寡肽，分為氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized,GSSG）和還原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）[4]。GSH是一種合成肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，參與體內糖代謝。GSH作為谷胱甘肽過氧化物酶，參與體內氧化還原過程，能和過氧化物及自由基結合，可清除生物體內有害自由基，結合自由基、有氧自由基、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽轉硫酶（Glutathione S-transferases,GSTs）等[5-6]。GSH 生物效應廣泛，臨床上主要在肝臟疾病應用較多，其在治療神經系統、消化系統疾病也有廣泛的應用[7]。有報道芪燈名目膠囊劑有效成分可以減輕糖尿病大鼠視網膜病變程度，主要和抑制氧化應激損傷有關[8]。一氧化氮（NO）是一種內源性血管擴張劑和神經遞質，在視網膜血流的調控機制和糖尿病視網膜病變的發生發展中起重要作用，作為體內NO 生成的主要限速因素[9]，誘導型一氧化氮合成酶（iN‐OS）在DR 形成中的作用也日益受到關注。因此，本文探討原型谷胱甘肽調控Nrf2/iNOS 信號對DR大鼠應激反應的作用，現研究如下。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠 48只SD大鼠，由南京君科生物工程公司提供，體重190~220 g，溫度（22±1）℃，分4 籠飼養，濕度45%~55%，大鼠活動飲水自由，給予大鼠一周時間習慣新環境，按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗，動物許可證號：SYXK（蘇）2018-0009。

1.2 主要儀器與設備 鏈脲佐菌素購買于北京厚嘉生物科技公司；GSH購買于上海聯碩寶為生物科技有限公司；SOD、MDA、GSH-Px 試劑盒購買于上海金畔生物科技公司；Nrf 抗體購買于無錫云萃生物科技；HO-1 抗體購買于廈門慧嘉生物科技；NO抗體購買于上海科敏生物科技；活性氧(reactive oxygen species,ROS)試劑盒子購自上海圻明生物公司；iNOS抗體購買于上海心語生物科技公司。

1.3 DR 大鼠分組及模型制備 用隨機法將48 只大鼠分為4組，每組12只，健康組、糖尿病視網膜病變大鼠組（病變組）、糖尿病視網膜病變大鼠給予還原型谷胱甘肽干預組（甘肽組）、糖尿病視網膜病變大鼠給予辛伐他汀干預組(他汀組)。健康組除外，其余三組建立糖尿病視網膜病變大鼠。用新配制的鏈脲佐菌素溶液按照55 mg/kg 的劑量行大鼠腹腔內注射，大鼠注射后72 h 收集尾靜脈測血糖，血糖水平≥16.7 mmol/L，糖尿病大鼠造模成功。分籠飼養4個月后監測尾靜脈血糖>16.7 mmol/L的大鼠采用戊巴比妥（40 mg/kg）進行腹腔注射麻醉，阿托品雙眼散瞳，鹽酸丙美卡因眼表面麻醉后進行眼前照相，并經尾靜脈注射0.2 mL 濃度為50 mg/mL 的異硫氰酸葡聚糖熒光素，眼底血管造影檢查眼底情況，同時具備4 個月持續糖>16.7 mmol/L 且眼底血管造影出現微血管瘤及滲漏的大鼠為DR 大鼠建模成功，本次實驗大鼠均建模成功[9]。

1.4 干預方法 建模成功后，甘肽組大鼠給予還原谷胱甘肽0.9%生理鹽水溶解后，2 mL/kg 注入大鼠腹腔，他汀組大鼠給予辛伐他汀0.2 mg/kg 灌胃，各組大鼠1/d，連續干預14 d。健康組及病變組大鼠不進行用藥，給予等體積檸檬酸緩沖液腹腔注射，時間及劑量相同。

1.5 標本組織采集 將各組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉處死后，十字型剪開眼眶骨組織后暴露眼球，取出整個眼球，立即進入PBS 沖洗，放入無菌玻璃器皿，在眼科手術顯微鏡下用眼科鑷剝離視網膜組織，低溫保存。

1.6 視網膜組織HE染色 將各組大鼠視網膜組織置于4%多聚甲醛液固定24 h，取出已經固定好的視網膜組織，梯度酒精脫水，透明，浸蠟包埋、切片取4μm 厚度，用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，水洗5 min，置于蘇木精染色10 min，水洗，置于伊紅染色10 min，再次梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察染色情況。

1.7 免疫熒光法檢測各組大鼠視網膜組織ROS 表達 取大鼠視網膜組織，用PBS 清洗，共清洗3 次，3%過氧化氫室溫孵育10 min，再用10%山羊血清封閉1 h，滴加一抗ROS（1：200），4 ℃過夜，于次日用PBS 清洗，共3 次，滴加二抗山羊抗兔（1：200），孵育1 h，再次PBS 沖洗3 次，滴加DA-PI 孵育10 min，抗熒光淬滅封片。熒光顯微鏡下觀察，檢測各組大鼠視網膜組織中ROS的表達。

1.8 檢測大鼠視網膜組織中SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力以及脂質過氧化物丙二醛（malonaldehyde, MDA）蛋白表達 取各組大鼠視網膜組織50 g 進行勻漿后離心，離心速度為1500 r/min，離心時間為10 min，取上清液。SOD 活性檢測采用WST-1 法，GSH-Px 活力檢測使用比色法，MDA 含量的檢測使用TBA 法，嚴格按照試劑盒操作，每個實驗檢測3次。

1.9 Western blot 檢測大鼠視網膜組織中核因子相關因子（Nrf2）2、HO-1、NO、iNOS 蛋白的表達 各組大鼠視網膜加入蛋白裂解液快速混勻，運轉離心機后保留上清液，放置在75 ℃水浴10 min使蛋白變性后放入樣孔中灌膠和上樣，每組取5 μg蛋白進行電泳實驗。將蛋白轉移到PVDF膜TBS浸泡10 min，反復PBS沖洗，每次5 min，加入1抗Nrf2、HO-1、NO、iNOS抗體(1:1000)，孵育過夜，后放入2抗辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（1:2000）雜交沖洗。浸入ECL工作液，檢測，顯色等步驟，成像系統對印跡條帶的光密度進行分析。GAPDH作為內參。

1.10 PCR法檢測大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1表達 各組大鼠視網膜組織研磨，提取總RNA，RNA反轉錄總cDNA，采用Trizol 法提取總RNA，無核酸酶溶解。將提取的RNA 進行轉錄為cDNA，獲得反體系，條件為：42 ℃作用60 min，72 ℃作用5 min，4 ℃終點。每個細胞設置6個復孔，以GAPDH為內參，反應條件為95 ℃預作用3 min，95 ℃作用5 s，58 ℃退火，40個循環。表1。

表1 引物序列

1.11 統計學處理 采用SPSS22.0 軟件進行分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 眼底熒光血管造影檢查視網膜病變大鼠成模情況 病變組大鼠眼底可見微血管瘤,后期滲漏,呈強熒光,毛細血管管壁著染,視網膜可見小片出血遮蔽熒光。健康組大鼠眼底未見明顯異常熒光，圖1。

圖1 眼底熒光血管造影檢查

2.2 各組大鼠視網膜HE 染色比較 健康組大鼠視網膜內、外核層細胞排列緊密、規律，表面光滑平整；病變組內外核細胞的單元間隙明顯縮小，細胞排列不規則，內在限制膜存在輕微腫脹，表面不光滑；他汀組和甘肽組細胞排列較規則，內在限制膜表面較光滑，病變明顯改善。圖2。

圖2 各組大鼠HE染色（×200）

2.3 各組大鼠視網膜組織中ROS 表達水平 與健康組大鼠ROS（1.00±0.00）比較，病變組大鼠視網膜組織中ROS(1.97±0.12)表達水平明顯升高（P<0.05）；與病變組比較，他汀組ROS 表達(1.75±0.11)和甘肽組視網膜組織中ROS 表達(1.13±0.09)水平明顯降低（P<0.05）；與他汀組比較，甘肽組ROS表達降低明顯（P<0.05）。圖3。

圖3 各組大鼠視網膜組織中ROS表達水平（×200）

2.4 各組大鼠視網膜組織氧化應激指標 與健康組比較，病變組視網膜組織中SOD、GSH-Px 水平降低，MDA水平升高（P<0.01），與病變組比較，他汀組和甘肽組視網膜組織中SOD、GSH-Px 水平明顯降低，MDA水平明顯升高（P<0.01），與他汀組比較，甘肽組SOD、GSH-Px水平升高明顯，MDA水平升高明顯（P<0.01）。表2。

表2 各組大鼠氧化應激指標比較（±s）

表2 各組大鼠氧化應激指標比較（±s）

與健康組比較，#P<0.01；與病變組比較，*P<0.01；與他汀組比較，▲P<0.01。

組別健康組病變組他汀組甘肽組FP n 12 12 12 12 SOD（ng/mL）629.21±29.45 401.36±20.14#503.34±15.49*#589.38±20.68*#▲168.30<0.001 GSH-Px（ng/mL）235.56±9.97 86.59±8.45#110.59±19.46*#199.54±14.95*#▲208.20<0.001 MDA（mmol/L）4.78±0.09 15.84±1.47#9.49±1.31*#6.01±0.75*#▲176.90<0.001

2.5 各組大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1 蛋白水平表達 與健康組比較，病變組視網膜組織中Nrf2、HO-1 蛋白水平降低（P<0.05），與病變組比較，他汀組和甘肽組視網膜組織中Nrf2、HO-1蛋白水平明顯升高（P<0.05），與他汀組比較，甘肽組視網膜組織中Nrf2、HO-1蛋白水平上升明顯（P<0.05）。表3，圖4。

表3 各組大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1水平比較（±s）

表3 各組大鼠視網膜組織中Nrf2、HO-1水平比較（±s）

與健康組比較#P<0.05；與病變組比較*P<0.05；與他汀組比較▲P<0.05。

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圖4 各組大鼠Nrf2、HO-1蛋白表達水平

2.6 各組大鼠視網膜組織中NO、iNOS 的蛋白水平表達 與健康組比較，病變組NO、iNOS 水平升高（P<0.05），與病變組比較，他汀組和甘肽組NO、iNOS 水平降低（P<0.05），與他汀組比較，甘肽組NO、iNOS水平降低明顯（P<0.05）。表4。

表4 各組大鼠NO、iNOS的水平表達（±s）

表4 各組大鼠NO、iNOS的水平表達（±s）

與健康組比較#P<0.05；與病變組比較*P<0.05；與他汀組比較▲P<0.05。

組別健康組病變組他汀組甘肽組FP n 12 12 12 12 NO 0.58±0.07 1.55±0.21#1.23±0.16*#1.05±0.13*#▲57.39<0.001 iNOS 0.46±0.05 1.41±0.19#?1.12±0.14*#0.97±0.11*#▲72.016<0.001

圖5 各組大鼠NO、iNOS蛋白水平表達

2.7 各組大鼠Nrf2、HO-1mRNA 的表達 與健康組比較，病變組Nrf2mRNA、HO-1mRNA 水平降低（P<0.05），與病變組比較，他汀組和甘肽組Nrf2mRNA、HO-1mRNA 水平明顯升高（P<0.05），與他汀組比較，甘肽組Nrf2mRNA、HO-1mRNA 水平明顯升高（P<0.05）。表5。

表5 各組大鼠Nrf2、HO-1mRNA表達的比較（±s）

表5 各組大鼠Nrf2、HO-1mRNA表達的比較（±s）

與健康組比較#P<0.05；與病變組比較*P<0.05；與他汀組比較▲P<0.05。

組別健康組病變組他汀組甘肽組F P n 12 12 12 12 Nrf2mRNA 1.00±0.03 0.32±0.02#0.55±0.04*#0.84±0.09*#▲123.600<0.001 HO-1mRNA 1.00±0.04 0.15±0.02#0.20±0.03*#0.42±0.02*#▲147.300<0.001

3 討論

糖尿病視網膜病變的發病機制尚無明確結論，糖尿病視網膜病變發展史復雜的病理過程，是多種因素共同作用所致，其主要的病理變化包括高血糖、微血管病變和神經組織病變等[10-11]。有研究顯示糖尿病引起的視網膜病變、肝臟等疾病，與機體內自由基增長和抗氧化能力下降有關[12-13]。還原型谷胱甘肽(GSH)是一種抗氧化劑同時也是機體內重要的還原劑，存在于人體各種組織和細胞中，具有調節體內蛋白質和核苷酸合成的作用，并與機體中的抗氧化能力有關[14]。糖尿病視網膜病變發病過程中氧化應激占主導位置[15]。辛伐他汀屬于他汀類藥物，對冠心病有較好的治療作用，同時還有降血脂的作用，除此之外，還可以促進血管新生，對糖尿病的視網膜病變有一定的治療作用，但是辛伐他汀對患者的肝臟功能及肌肉反應有影響。目前研究顯示高血糖引起的活性氧簇增多是DR 發病的始動因素。ROS將導致多種視網膜細胞功能障礙，包括視網膜神經節細胞的凋亡及視網膜血管內皮細胞功能的紊亂[16-17]。有學者通過研究紅斑狼瘡患者發現，GSH 可以下調患者中性粒細胞ROS 的水平，在紅斑狼瘡的治療中起到了積極作用[18]。在糖尿病患者氧化應激過程中，各種氧自由基不斷攻擊視網膜，發生脂質過氧化作用。有研究發現DR 大鼠視網膜細胞出現氧化應激損傷，MDA 水平升高，SOD和GSH-Px活力降低，說明DR大鼠處于氧化應激狀態，控制機體自由基平衡，有助于糖尿病視網膜病變的控制。SOD 是重要的抗氧化酶,其可清除細胞內過多的活性氧，保護細胞免受自由基的氧化損傷。原型谷胱甘肽能和自由基結合，對抗氧化對巰基的破壞，保護身體重要臟器，可以免受自由基的破壞。谷胱甘肽參與人體的氧化還原反應，同時還可調節細胞的增生。還原型谷胱甘肽是減少細胞內氧化應激作用的重要物質，GSH-Px 作用降低時，GSH 的生成會減少，導致細胞內氧化應激反應增加，造成細胞損傷[19]。徐輝勇等研究發現經過柚皮素干預后，糖尿病視網膜病變大鼠的視網膜組織中的MDA 水平明顯下降，SOD 和GSH-Px活力明顯升高，柚皮素可以拮抗氧化應激，減輕DR 大鼠視網膜病變[20]。本文研究發現病變組SOD、GSH-Px水平降低，MDA、ROS 表達水平升高，經過干預后，甘肽組SOD、GSH-Px 水平升高，MDA、ROS 表達水平降低明顯。本文研究和上述研究一致。

Nrf2 是一種維持細胞氧化應激的重要轉錄因子。正常條件下，Nrf2 存在于細胞質中，ARE 存在于細胞核內，受到自由基刺激時，活化的Nrf2 進入細胞核，并與ARE結合，從而啟動受Nrf2-ARE調控的氧化還原酶類，調控抗氧化酶，進而提高細胞的抗氧化應激能力。有研究表明葡萄籽原花青素可增加DR大鼠視網膜Nrf2和HO-1的表達水平，激活Nrf2 來改善氧化應激介導的DR 大鼠視網膜損傷[21]。Nrf2 通路具有抗氧化、抗細胞凋亡、神經保護等多種作用，同時在糖尿病視網膜病變中起到一定作用[22]。到目前為止很多的實驗和研究亦已證明Nrf2在高氧化應激狀態的疾病中都有保護作用，并決定了機體對氧化應激的敏感性和機體炎性反應的嚴重程度。糖尿病視網膜病變大鼠的GSH-Px活力降低時，GSH 的生成會減少，GSH-Px和Nrf2在糖尿病視網膜病變中成正相關。原型谷胱甘肽是含有巰基的體內最重要的抗氧化物之一，在酶的催化下能與過氧化物和自由基結合，對抗氧化物的破壞作用。GSH 能激活多種酶，促進糖、脂肪及蛋白質的代謝。有研究還原谷胱甘肽可以通過P38MAPK 通路誘導HO-1 的表達來組織腎臟近曲小管上皮細胞氧化應激的損傷。本文研究發現糖尿病大鼠視網膜發生病變時Nrf2、HO-1 水平降低，經過原型谷胱甘肽干預后甘肽組Nrf2、HO-1 水平上升，說明原型谷胱甘肽可干預Nrf2-ARE 信號通路對DR疾病的發生發展有影響。

NO 是體內最強的血管擴張因子，同時也是活躍的免疫分子和炎癥介質，在糖尿病視網膜病變中不僅參與視網膜血流動力學和血液流變學改變，還能增加視網膜血管通透性，參與破壞血-視網膜屏障，還影響視網膜神經節細胞的功能。NO 的合成有賴于一氧化氮合酶(NOS)，同時多種細胞表達誘導型NOS(iNOS)增多，導致cNOS／iNOS 失衡，NO合成過量[23]。NOS 在高糖刺激下可以導致視網膜細胞中iNOS的表達增加，導致NO 增加，NO 的過量產生和釋放則具有細胞毒性和細胞抑制作用，尤其是源于iNOS 的過度表達而產生的NO。高血糖時體內氧化應激反應增強，也使iNOS表達增強，產生一系列自由基引起的氧化及硝化損傷，在視網膜神經元以及血管的結構與代謝方面產生損傷作用，從而加速DR 的進展。還原谷胱甘肽可以抑制TNF、IL-6 等炎癥因子的活化，減少iNOS 的合成，使NO產生減少，減輕炎癥反應對腎臟的損害。還原谷胱甘肽可與白細胞在氧化應激時產生的過氧化酶衍生氧化物，阻止其進一步參與氧自由基生成反應，減少氧化反應和炎癥反應相互作用。本研究原型谷胱甘肽可顯著降低iNOS、NO 蛋白水平表達，增加Nrf2 和HO-1 表達量，同時降低ROS 和NO 水平，由次推斷說明原型谷胱甘肽能夠通過促進Nrf2 和HO-1 表達，抑制iNOS 表達，進而降低細胞炎癥反應，減少細胞ROS產生，對細胞起到保護作用。

綜上所述：還原型谷胱甘肽可以調控Nrf2/iNOS 信號通路，改善氧化應激反應，對糖尿病視網膜病變其保護作用。