葛根芩連湯對糖尿病腎病大鼠腎組織的保護作用

郭志伯，馬李娜，劉丹陽

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是由II型糖尿病引起的一種慢性多功能退行性并發癥，約有30%的糖尿病患者發展為DN[1]。DN是導致末期腎衰竭及死亡的主要原因，嚴重影響世界人口的健康水平，給社會造成沉重的經濟負擔[2]。其特點是腎臟的形態、超微結構和功能變化，蛋白尿，細胞外基質蛋白的過度沉積等[3]。DN發病機制復雜，嚴重影響糖尿病患者的預后和生存，研究顯示，DN患者的病死率比單純糖尿病患者的病死率高3~12 倍，而且DN的發展增加了心血管發病率和病死率的風險[4-6]。目前，迫切需要新的療法來減輕糖尿病并發癥的風險。

葛根芩連湯（Gegen Qinlian decoction，GQD）是一種中藥方劑，以葛根為主，并輔以黃連、黃芩和甘草組成，具有疏風解表、燥濕止利之功效。研究發現，GQD可以有效的用于糖尿病及其并發癥的預防和治療[7-9]。目前臨床上對于DN治療尚無特效的措施，雖然臨床上常用的西藥種類繁多，但是其使用對肝腎功能損害較大，因此，GQD 等中藥在DN 的治療上具有較大潛力。由于GQD 成分復雜，其機制尚不清楚，本研究旨在探討GQD 對DN 大鼠腎組織的保護作用及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級SD 大鼠，雌雄各半，體質量200 g 左右，30 只，8 周，購自中國軍事醫學科學院實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（軍）2007-004。飼養于河北醫科大學動物實驗室，12 h/12 h 明暗交替，溫度22 ℃±2 ℃，濕度50%±5%。自由進水飲食。實驗過程符合河北醫科大學實驗動物倫理委員會規定。

1.2 試劑和儀器 鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ,Sigma 公司，美國)，體重計（美國GE 公司），骨形成蛋白（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydro‐genase，GAPDH）、SMAD 家族成員1（SMAD family member 1，Smad1）、Smad4 兔抗大鼠多克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（英國Abcam 公司），BCA 蛋白定量（Bicinchoninic Acid Assay，BCA）試劑盒、原位末端轉移酶標記技術（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL）凋亡試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），Trizol(Invitrogen 公司，美國)，Western blot電泳儀（BIO-RAD 公司，美國），7500-Fast 實時PCR系統（Applied Biosystems，美國），葛根、炙甘草、黃連、黃芩（北京同仁堂藥店），相關引物由上海生工（中國）合成。

1.3 糖尿病腎病大鼠模型制備 GQD 按《傷寒論》步驟制備：取葛根250 g，黃芩150 g，黃連150 g，炙甘草100 g，用10倍質量的水分別對各中藥進行20 min浸泡。先煎葛根，水沸后煎煮20 min,加入其余已浸泡的藥湯繼續煎至40 min，過濾后，殘渣中加8倍量的水，煎煮30 min，把2 次濾過的湯劑混合，調整全方生藥量2 g/mL，濃縮水煎液后備用。30 只SD大鼠隨機分為3組，每組10只。對照組以生理鹽水l灌胃，余20 只采用高脂飼料喂養+STZ 腹腔注射制作DN大鼠模型，造模大鼠均高脂飼料喂養，按文獻方法腹腔注射STZ，每周1次，連續3周，造模完成后72 h 后，經尾靜脈采血測血糖，血糖16.7 mmol/L 為糖尿病模型復制成功。1 周后留取大鼠即刻尿，測尿微量白蛋白及尿肌酐，模型組的尿微量白蛋白/尿肌酐顯著高于正常對照組，即為DN大鼠造模成功。20 只均造模成功。GQD 組：按生藥量10 g/kg GQD灌胃，1次/日，模型（DN）組同法灌胃相同體積的生理鹽水，3組均持續灌胃12周。

1.4 血糖、血清胰島素、血肌酐和尿素氮及24 h 尿蛋白的水平 各組處理結束后，行主動脈取血，部分滴至血糖試紙測量血糖濃度，取部分血漿，利用ELISA 試劑盒操作說明測定各組血漿胰島素水平。另取部分血液，離心半徑10 cm，4 000 r/min離心3 min。取血清，使用肌酐測試試劑盒（苦味酸不除蛋白法）測定血清肌酐水平；使用尿素氮試劑盒（尿酶法）測定血清尿素氮的水平。收集各組大鼠24 h 尿液，混勻，用移液槍各取尿量5 mL，離心半徑10 cm ，5 000 r/min 離心3 min。吸取上清液，放入全自動生化儀，檢測各組大鼠24 h的尿蛋白水平。

1.5 炎癥因子測定 大鼠禁食12 h，頸總動脈取血，離心半徑10 cm，4 000 r/min離心10 min。后取上清即得血清，采用ELISA 試劑盒檢測血清白細胞介素-6（interleukin，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）炎癥因子的水平，操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.6 大鼠臟器指數測定 實驗結束后，對各組大鼠均進行3 次體質量測定，并稱重。后對以上各組大鼠腹腔麻醉，取左腎組織，置于培養皿中，并進行稱重。同時計算臟器指數，臟器指數= 腎臟重量/大鼠體質量×100%。

1.7 腎臟組織細胞凋亡檢測 實驗結束后，每組隨機選取3 只大鼠腎組織，制作石蠟切片，應用末端脫氧核苷酸轉移酶介導dUTP 缺口末端標記法（TUNEL）檢測細胞凋亡。實驗結束后，破片經甲醛固定，磷酸緩沖液清洗3 次，室溫下依次進行1%Tritonx-100 通透，TdT 酶反應液反應、顯色，在顯微鏡下觀察，并統計TUNEL+細胞數。

1.8 qRT-PCR 檢測相關基因mRNA 水平變化 實驗結束后，每組隨機選取3只大鼠的腎組織。立即加入Trizol 試劑（Invitrogen）提取總RNA，用NanoDrop ND-2000檢測總RNA的質量和濃度。利用逆轉錄酶合成cDNA，逆轉錄的反應條件為：25 ℃10 min，48 ℃30 min，95 ℃5 min。利用SYBR Green PCR試劑盒檢測相關mRNA的表達水平，通過7500-Fast實時PCR系統上機檢測。反應條件：95 ℃5 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，進行40個循環。利用2-ΔΔCt法計算進行結果分析。所用引物序列見表1。

表1 QPCR的引物序列

1.9 腎組織相關蛋白水平測定 每組隨機選取3只大鼠腎臟組織，磷酸緩沖液清洗組織后加入裂解液，組織勻漿、超聲裂解離心后獲得蛋白樣本。采用BCA 法測量蛋白濃度，將所有樣本的蛋白定容至等濃度。進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將凝膠中的蛋白轉入聚偏二氟乙烯膜，加入Abcam 公司兔抗鼠一抗PI3K（1：2 000）、p-PI3K（1：2 000）、AKT（1：3 000）、p-AKT抗體（1：3 000），4 ℃孵育聚偏二氟乙烯膜過夜，隨后使用HRP 標記的山羊抗兔二抗（WLA023a；1：1 000）常溫孵育1 h，用ECL Plus Western 印跡檢測試劑進行顯色。

1.10 統計學處理 應用SPSS24.0軟件，變量資料采用均數±標準差()表示，兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血糖、血清胰島素、血肌酐和尿素氮及24 h 尿蛋白的水平變化 與對照組比較，DN 組大鼠血糖、血肌酐和尿素氮及24 h尿蛋白的水平明顯升高（t= 64.08, 30.14, 24.12, 19.36; 均P<0.05），血清胰島素水平降低（t=23.95,P<0.01），GQD 處理組大鼠血糖、血肌酐和尿素氮及24 h尿蛋白顯著降低（t= 52.26, 18.00, 20.56, 13.94; 均P< 0.05），血清胰島素水平升高（t=15.83,P<0.01），表2、圖1。

表2 各組大鼠血糖、血清胰島素、血肌酐和尿素氮及24 h尿蛋白的水平比較（±s）

表2 各組大鼠血糖、血清胰島素、血肌酐和尿素氮及24 h尿蛋白的水平比較（±s）

與對照組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05

分組對照組DN組GQD組例數10 10 10血清胰島素（mU/L）23.05±1.06 11.61±1.08*18.81±0.95#血糖水平3.54±0.05 25.51±1.08*6.62±0.37#血肌酐（μmol/L）24.86±1.26 43.15±1.45*32.98±1.04#尿素氮（mmol/L）11.17±0.60 20.45±1.06*12.87±0.49#24 h尿蛋白（μg/d）21.92±1.09 32.40±1.32*25.26±0.94#

圖1 各組大鼠血清胰島素、血糖、血肌酐和尿素氮及24 h尿蛋白的水平比較

2.2 各組大鼠臟器指數變化 通過測量各組大鼠的體質量和腎臟重量變化可知，與對照組比較，DN組大鼠體質量下降，腎臟重量增加，臟器指數升高（t=15.90,P<0.05）；與DN 組比較，GQD 組大鼠體質量增加，腎臟重量減小，臟器指數下降（t=11.09,P<0.05），表3、圖2。

表3 各組大鼠臟器指數（±s）

表3 各組大鼠臟器指數（±s）

與對照組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05

分組對照組DN組GQD組例數10 10 10體質量（g）197.96±4.76 164.14±10.34 184.47±7.25腎臟重量（g）1.15±0.04 1.56±0.03 1.25±0.03臟器指數0.58±0.02 0.95±0.07*0.68±0.04#

圖2 各組大鼠臟器指數比較

2.3 各組大鼠血清炎癥因子變化 ELISA 結果顯示，與對照組比較，DN 組大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α水平均明顯升高（t=36.55,31.90;均P<0.05）；與DN 組比較，GQD 組大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α 水平明顯降低（t=33.42, 26.48; 均P< 0.05），表4、圖3。

表4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（±s）

表4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（±s）

與對照組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05

分組對照組DN組GQD組例數10 10 10 IL-6(pg/mL)1.11±0.08 5.55±0.37*1.41±0.11#TNF-α(pg/mL)0.43±0.03 4.54±0.40*0.95±0.13#

圖3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

2.4 各組大鼠腎組織細胞凋亡水平變化 TUNEL結果顯示，與對照組比較，DN組大鼠細胞凋亡水平升高（t=17.10,P<0.05）；與DN 組比較，GQD 組大鼠細胞凋亡水平明顯降低（t=6.67,P<0.05），表5、圖4。

表5 各組大鼠腎臟組織細胞凋亡水平變化比較（±s）

表5 各組大鼠腎臟組織細胞凋亡水平變化比較（±s）

與對照組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05

分組對照組DN組GQD組例數3 3 3細胞凋亡率4.72±0.62 29.65±2.45*14.46±3.09#

圖4 各組大鼠腎臟組織細胞凋亡水平變化比較（×200）

2.5 各組大鼠PI3K、AKT mRNA 和蛋白磷酸化水平變化 qRT-PCR 及蛋白印記結果顯示，與對照組比較，DN 組大鼠PI3K、AKT mRNA 水平表達降低，蛋白磷酸化水平降低（t=15.79, 16.88, 19.44, 13.86;P<0.05）；與DN 組比較，GQD 組大鼠PI3K、AKT mRNA 水平表達升高，蛋白磷酸化水平升高（t=7.76,5.67,9.52,5.88;P<0.05），表6、圖5。

圖5 各組大鼠腎臟組織PI3K、AKT及其蛋白磷酸化表達變化比較

表6 各組大鼠腎臟組織PI3K、AKT mRNA及其蛋白磷酸化表達變化比較（±s）

表6 各組大鼠腎臟組織PI3K、AKT mRNA及其蛋白磷酸化表達變化比較（±s）

與對照組比較，*P<0.05；與DN組比較，#P<0.05

分組對照組DN組GQD組例數3 3 3 mRNA PI3K 1.74±0.13 0.45±0.05*1.29±0.18#AKT 1.04±0.06 0.29±0.05*0.63±0.09#蛋白磷酸化水平p-PI3K 0.96±0.07 0.12±0.03*0.77±0.12#p-AKT 0.39±0.04 0.07±0.02*0.22±0.09#

3 討論

DN 屬于臨床上常見疾病，屬于糖尿病誘發的腎臟微血管并發癥，其特征是蛋白尿和腎功能的逐漸喪失，是末期腎病的主要原因[10-11]。全世界糖尿病的患病率已經達到流行程度。目前，糖尿病已經影響到全球8%以上的人口（近3.5 億人），預計到2035 年將增加到5.5 億人以上[12]，據統計，超過40%的糖尿病患者會患上慢性腎病[13]。DN 具體發病機制復雜，缺乏特異性治療方法。迫切需要發現特異性有效藥物應用于DN的臨床治療。

GQD是一種著名的中草藥配方，在中國使用已經近2 000年，被廣泛應用于治療胃腸道疾病，特別是傳染性腹瀉[14]。GQD 除了改善腹瀉小鼠的身體狀況外，還表現出顯著的抗炎活性，抑制炎癥因子的釋放，有助于腸道黏膜炎性損傷的恢復[15]。最近的研究證實，GQD被廣泛的應用于II型糖尿病的治療[16-17]。DN是由糖尿病引起的嚴重并發癥，炎癥因子IL-6是臨床上應用廣泛的促炎因子，其升高往往反應機體炎癥反應的產生，TNF-α 是機體重要的免疫調節因子，在DN 患者血清中IL-6 和TNF-α 水平顯著升高[18-19]。本研究中，DN大鼠血清IL-6、TNF-α炎癥因子的急劇升高，說明本實驗大鼠模型制備成功。GQD處理能降低DN模型組大鼠腎組織處炎癥因子IL-6和TNF-α的釋放，提示GQD處理可以緩解DN 大鼠炎癥損傷。基于PI3K/AKT 信號通路對于調控炎癥反應具有重要作用[20]。研究顯示，DN模型存在信號通路狀態的紊亂，如高嘯等人[21]的研究表明HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB 相關蛋白在DN小鼠中表達升高。本研究檢測了PI3K/AKT信號通路的狀態，結果顯示，DN大鼠腎組織PI3K、AKT 磷酸化水平下降，GQD 處理能提高PI3K/AKT 蛋白磷酸化的水平。提示GQD 可增強PI3K/AKT 的水平。除此之外，還檢測了血糖、血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白得含量，血肌酐可以用來判斷腎功能損傷程度，其他3 項指標也有助于輔助綜合分析腎臟的損傷，結果顯示，GQD 處理后，以上指標均顯著降低，說明GQD能顯著改善DN大鼠的腎臟損傷。

本研究采用高脂飼養+STZ 腹腔注射制備DN大鼠模型，此方法方便簡單，可行性較強。實驗結果表明，GQD 處理能夠抑制DN 大鼠的炎癥水平，抑制腎臟細胞凋亡水平，改善DN 大鼠的腎臟損傷，機制研究發現，GQD 可能通過PI3K/AKT 信號通路發揮作用。