促紅細胞生成素對大鼠磨牙牙髓血運重建術后SDF-1和VEGF表達水平及疼痛的影響

王 芹, 李立恒, 王鐘華, 楊永超, 馮建梅, 胥愛文, 安 峰, 申葉春

(河北北方學院附屬第一醫院口腔科, 河北 張家口 075000)

牙髓屬于牙齒中唯一的疏松結締組織,發揮感覺及外界防御作用,當牙齒損傷導致牙髓感染或壞死,降低牙髓活力及牙齒壽命[1]。牙齒損傷后血運減弱,其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達降低,VEGF具有促進牙髓組織血管形成,提高牙髓損傷修復能力[2]。基質細胞衍生因子1(SDF-1)屬于趨化因子之一,在神經、血管及軟骨等部分發揮修復及再生作用[3]。在牙齒脫位后牙髓無壞死時保持牙髓活力,及時進行牙髓血運重建至關重要。目前隨著分子生物學的發展,在牙齒血運重建過程中認為促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)對于牙齒具有保護作用[4]。相關學者證實EPO能夠通過增加VEGF水平,有助于拔牙大鼠血運重建[5],本文以EPO對磨牙牙髓SDF-1因子的水平及炎性因子水平作為創新點進行實驗研究,為牙髓損傷的修復再生提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠:48只SPF級SD大鼠來自河北北方學院附屬第一醫院,200g±25g,飼養于動物房內,每個籠子有4只大鼠,實驗期間均自由飲水及攝食,喂養一周后進行實驗,動物許可證號：SYXK(冀)2018-0016。

1.2主要試劑與儀器:EPO(西寶生物科技)；慶大霉素及生理鹽水(遼寧民康藥業)；4%多聚甲醛(江蘇世泰實驗器材)；SDF-1抗體(亞科因(武漢)生物)；VEGF及GAPDH抗體(羅氏公司)；HE試劑盒(康迪斯化工(湖北))；BCA蛋白試劑盒(天津金克隆生物技術)；DL-S OOOB低溫離心機(上海安亭)；光學顯微鏡(舜宇光學科技(集團)。

1.3大鼠無髓根管模型建立:參考文獻[8],選擇牙齒完好無病癥的大鼠,選擇雙側下頜第一磨牙作為實驗牙齒,將實驗牙齒近中及遠中根管作為實驗根管,按照50mg/kg腹腔注射1%的戊巴比妥鈉麻醉,開髓,疏通根管后,使用NaClO溶液浸泡根管溶解牙髓并用生理鹽水沖洗；依次使用10#、15#、20#H銼拔髓,1.5%NaClO溶液和17%EDTA溶液交替沖洗,直至根管內無明顯滲出,干燥根管后使用氫氧化鈣糊劑進行根管封藥,MTA封閉根管口,流動樹脂充填窩洞。

1.4分組及干預方法:將48只大鼠分為正常組、模型組、250IUEPO組及500IUEPO組,均12只,除正常組外,其余大鼠均進行無髓根管模型建立及血運重建,EPO-A組及EPO-B組均腹腔注射250IU/Kg的EPO及500IU/Kg的EPO,其余大鼠均腹腔注射相同體積的0.9%的生理鹽水。連續注射14d,每日一次。

1.5酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清炎性因子:各組大鼠干預14d后,次日清晨空腹狀態下取尾部靜脈血1mL,放入抗凝離心管中分離低速離心機按照3000r/min運轉20min,保留血清,采用ELISA法檢測檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)及白細胞介素-1β(IL-1β)水平。

1.6組織提取:各組大鼠干預14d后,麻醉處死大鼠(1%戊巴比妥鈉),保留下頜骨放入10%的甲醛溶液中,固定過夜,自來水沖洗,浸泡于14%的EDTA溶液中脫鈣,逐層脫水后石蠟包埋后4μm切片后村村備用。

1.7HE染色觀察根管組織病理形態:各組大鼠組織切片放入37℃復溫15min,二苯甲脫蠟后按照100%-95%-85%及75%乙醇進行逐層脫水,蘇木精染色10min,1%鹽酸酒精處理10s,放入飽和碳酸鋰中返藍,加入伊紅染色液染色10s,再次逐層脫水后中性樹脂封片后顯微鏡觀察組織形態。

1.8免疫印跡檢測根管組織SDF-1及VEGF蛋白表達:根管組織采用1%裂解液,離心后保留上清液采用BCA檢測蛋白,加入樣品后,進行SDS-PAGE電泳,轉入聚偏二氟乙烯膜,封閉60min,加入SDF-1及VEGF (1∶500),內參為GAPDH(1∶500),加入辣根氧化酶2抗(1∶2000),搖勻,采用TBST沖洗膜,最后ECI話化學發光顯色,試驗重復3次取平均值。

1.9人牙髓干細胞培養、分組及處理:將購自北京澤平公司的人牙髓干細胞放入37℃、5%CO2飽和濕度下培養,生長至80%～90%時進行傳代,放入15mL的離心管中1000r/min,5min后,棄去上清液放入培養基中2～3d傳代。將人牙髓干細胞分為正常組、EPO組、SDF-1組及VEGF組,EPO組人牙髓干細胞中加入10U/mL的EPO共培養,SDF-1組及VEGF組則分別加入100μg/L的SDF-1及10ng/mL的VEGF培養,正常組為人牙髓干細胞添加PBS培養液。

1.10CCK-8檢測各組人牙髓干細胞增殖:取對數生長的第3代人人牙髓干細胞接種到96孔板中,數量5×108·L-1,沒孔體積200μL,在37℃飽和濕度下培養24h、36h和72h,均加入5g/L CCK-8試劑,繼續培養2h,全自動酶標儀450nm下檢測吸光度,計算增值率。公式：藥物處理組吸光度值/空白對照組吸光度值×100%,取3次平均值。

1.11qRT-PCR檢測各組人牙髓干細胞細胞SDF-1及VEGF mRNA相對表達:提取各組培養后的人牙髓干細胞細胞,數量為1×105個/孔,去培養基后,PBS沖洗,加入200μL氯仿,離心后加入乙醇,沉淀后進行7000轉高速離心,提取RNA。將RNA逆轉錄為DNA,以β-actin為內參,反應條件：98℃6min,98℃28S,75℃30S,80℃4min,總計55個循環,見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1各組大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平比較:與和正常組相比,模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高(P<0.05),與模型組相比,EPO-A組及EPO-B組大鼠血清中炎性指標均降低(P<0.05),且EPO-B組血清中炎性指標低于EPO-A組,組間比較有差異(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清中TNF-α IL-6及IL-1β水平比較

2.2HE觀察各組大鼠根管組織形態:正常組：大鼠牙根管組織有大量的梭形成纖維細胞分布,結締組織緊致分布；模型組：根管內部分為不規則的礦化基質,未見血管形成,根尖內存在大量炎性細胞,并先根管內部延申并部分進步根管內。EPO-A組及EPO-B組根管內存在不規則礦化,在根尖1/3處可發現新生血管,有少量炎性細胞分布根尖周圍。見圖1。

圖1 各組大鼠根管組織病理形態比較(200×)

表3 各組大鼠根管組織SDF-1及VEGF蛋白水平

2.3免疫印跡檢測各組大鼠根管組織SDF-1及VEGF蛋白水平:模型組大鼠根管組織中SDF-1及VEGF蛋白表達水平低于正常組(P<0.05),EPO-A組及EPO-B組SDF-1及VEGF蛋白表達水平高于模型組(P<0.05),EPO-B組與EPO-A組比較差異顯著(P<0.05),見表3、圖2。

圖2 各組大鼠根管組織SDF-1及VEGF蛋白電泳圖

圖3 光學檢顯微鏡觀察人牙髓細胞分化(A：100×,B：200×)

2.4人牙髓細胞分化實驗:人牙髓細胞克隆至第二代時,倒置顯微鏡下觀察細胞形態,鏡下可見,細胞生長狀況良好,呈梭形或星形,細胞間排列緊密,胞漿豐富,胞漿的突起互相連接,細胞核呈卵圓形,位于細胞中央,有明顯的核仁。見圖3。

2.5各組人牙髓細胞相對增殖率比較:EPO組、SDF-1組及VEGF組人牙髓細胞的在24h、48h及72h的相對增殖率均高于正常組(P<0.05),EPO組、SDF-1組及VEGF組24h、48h及72h相對增殖率比較無意義(P>0.05),組內不同時間比較,EPO組、SDF-1組及VEGF組均隨著時間延長而相對增值率升高(P<0.05),見表4、圖4。

表4 各組人牙髓細胞相對增殖率比較(%)

圖4 各組人牙髓細胞相對增殖率比較

表5 各組人牙髓細胞中SDF-1及VEGF mRNA表達比較

2.6各組人牙髓細胞中SDF-1及VEGF mRNA表達比較:與正常組相比,EPO組、SDF-1組及VEGF組細胞中SDF-1及VEGF mRNA表達升高(P<0.05),EPO組、SDF-1組及VEGF組SDF-1及VEGF mRNA水平無意義(P>0.05),見表5,皮爾森相關系數分析結果顯示：SDF-1mRNA與VEGF mRNA呈現正向相關性(r=0.576,P=0.003),見圖5。

圖5 各組人牙髓細胞中SDF-1及VEGF mRNA相關性分析

3 討 論

牙髓血運重建術作為改善牙髓感染后壞死或根尖且未閉合的年輕恒牙的治療方案,已經過大量動物及臨床試驗證實其能夠為牙根生長及根管壁增厚提供理想治療效果[5,6],但是在此過程中牙新生組織多為牙骨礦化物質,而非真正的牙髓組織,從而影響恢復效果。細胞因子在機體炎癥反應表達異常,TNF-α、IL-6及IL-1β等細胞因子在牙髓損傷及壞死時表達升高,被認為是牙髓疾病重要炎性因子,主要原因與在牙齒損傷后激活巨噬細胞M1表達而分泌大量炎性因子,提高炎癥反應。本文研究證實,大鼠牙髓進行血運重建后,大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β等表達升高,采用EPO腹腔注射后可降低炎性水平,說明EPO能夠減少牙髓血運重建后的炎性表達而降低疼痛。EPO屬于能夠通過激活紅系造血組細胞而通過加快紅細胞生成應用于臨床多種疾病的治療,例如惡性腫瘤合并貧血等。近些年研究證實,EPO對骨生成也發揮重要作用。EPO能夠通過降低細胞間粘附分子-1(ICAM-1)和血管細胞間粘附分子-1(VCAM-1)而抑制巨噬細胞表達[7]。Mahboubeh R[8]研究證實,在口腔黏膜炎中EPO能夠同抑制TNF-α等炎性因子的表達而減少活性氧氧化應激,改善口腔炎癥,緩解疼痛。本文與 Vajihe[9]研究相似。

本文對人牙髓細胞采用EPO、VEGF及SDF-1培養后發現EPO、VEGF及SDF-1均能夠刺激人牙髓細胞增殖,說明EPO、VEGF及SDF-1能夠作為牙髓再生修復因子而發揮牙髓修復,促進牙髓修復及血管再生作用。在人牙髓細胞中EPO能夠調節神經節樣細胞分化,主要是通過激活p38MAPK表達促進人牙髓細胞增殖。高糖環境中人牙髓細胞增殖受到抑制后,外源性上調EPO后可提高人牙髓細胞在高糖環境下的成骨能量,說明EPO能夠提高牙髓細胞堿性磷酸酶活性,增加牙髓細胞增殖能力。VEGF在牙齒發育及牙髓損傷愈合修復方面具有重要作用,通過內皮細胞分化、促進血管再生,保護牙齒提高細胞繁育。在牙髓細胞損傷后VEGF短暫性表達上調發揮修復損傷作用。SDF-1能夠抑制人牙髓細胞成牙本質分化,通過上調骨形態發生蛋白2(BMP2)表達而對人牙髓細胞發揮趨化效應而增加活性。也有研究表明EPO能夠促進內皮細胞增殖,加強血管形成能力,從而抑制血管收縮,其主要通過調節磷酸化Janus激酶(JAK2)信號轉導因子及轉錄活化因子(STAT3)的表達來提高VEGF水平,參與牙髓修復作用[10]。

綜上所述：促紅細胞生成素能夠降低大鼠磨牙牙髓血運重建術后炎癥水平,緩解疼痛,并通過提高SDF-1、VEGF表達促進血管新生,參與血運重建。