八月札水提物對膠質瘤細胞EMT的作用機制研究

劉 軍, 祁大勇, 趙志煌, 李 剛, 韓永剛

(1.河北省邯鄲市第一醫院神經外科, 河北 邯鄲 056000 2.河北省唐山市工人醫院神經外科, 河北 唐山 063000 3.河北省滄州市中心醫院神經外科, 河北 滄州 061000)

腦膠質瘤是顱內常見的中樞神經系統惡性腫瘤,具有惡性程度高、侵襲性強、預后效果差及病死率高等特點,受到全球的高度關注[1]。八月札又名“八月楂”,是木通屬植物成熟果實的總稱,其主要成分為常春藤皂苷元。研究表明,常春藤皂苷元可作為有效的自噬抑制劑,從而增強肺癌細胞對紫杉醇和順鉑的敏感性[2]。此外,常春藤皂苷元通過調節凋亡相關蛋白,可誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡,降低其增殖活性[3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是長度超過200個核苷酸的一種非編碼RNA,主要參與染色質修飾和轉錄,LncRNA腫瘤易感基因(LncRNA CASC11)與多種腫瘤的發生發展有關,研究發現,在膀胱癌和食管癌等惡性腫瘤中CASC11均出現高表達[4,5]。微小RNA(micro RNA,miRNA)是長度在25個核苷酸內的非編碼RNA,研究報道,miR-641表達下調與低密度脂蛋白誘導的人血管平滑肌細胞增殖、遷移和侵襲有關[6]。本研究以膠質瘤細胞SHG-44為研究對象,探討八月札水提物是否可通過調節CASC11/miR-641信號軸影響膠質瘤細胞的生物行為學及對上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影響。

1 材料與方法

1.1細胞系:膠質瘤細胞SHG-44購自美國ATCC公司。

1.2試劑和儀器:八月札購自安徽亳州奇弘堂藥業有限公司,水提物制備：將中藥粉碎后按1∶8比例加入蒸餾水,浸泡15h后,煮沸30min,收集藥液,重新加入蒸餾水煮30min后,收集藥液,將2次收集的藥液混勻后,45℃減壓濃縮,干燥后得到八月札水提物固體干粉,使用前用蒸餾水進行稀釋。

1.3CASC11 si-NC和CASC11 mimic(上海吉瑪制藥公司)；CASC11和miR-641 PCR引物(廣州銳博生物科技有限公司)；兔抗人上皮鈣粘蛋白(E-cadherin,E-cad)、神經鈣粘蛋白(N-cadherin,N-cad)和波形蛋白(vimentin)(美國Abcam公司)；熒光定量PCR儀(美國AMI公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4MTT法檢測細胞存活率:取對數生長期的SHG-44細胞,重懸,制成密度為1×105個/mL的細胞懸液,接種于96孔板,每孔100μL,待貼壁后,不同濃度(0、30、60、90、120和180μg/mL)八月札水提物培養,24h后,MTT液10μL培養4h,加入150μL二甲基亞砜,混勻,酶標儀450nm波長處測定吸光度(A)值,計算細胞存活率=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.5細胞轉染與分組:取對數生長期的SHG-44細胞,重懸,制成密度為1×105個/mL的細胞懸液,接種于96孔板,每孔100μL,隨機分為對照組、八月札水提物組、NC組、CASC11 mimic組和八月札水提物+CASC11 mimic組,待細胞融合度達到80%以上時,八月札水提物組細胞用含八月札水提物90μg/mL的培養基培養24h,NC組細胞轉染NC 24h,CASC11 mimic組細胞轉染CASC11 mimic 24h,八月札水提物+CASC11 mimic組細胞轉染CASC11 mimic 24后,棄掉原有培養基,加入含八月札水提物90μg/mL的培養基繼續培養24h,對照組和八月札水提物組不做處理。

1.6qRT-PCR檢測CASC11和miR-641表達水平:離心收集細胞,Trizol液提取總RNA,將1μL總RNA逆轉錄得到cDNA,以cDNA為模板進行擴增,PCR反應條件為95℃ 10min,95℃ 30s,60℃ 15s,72℃ 20s,共進行40個循環,根據獲得的擴增曲線和Ct值,分別以GAPDH和U6為內參基因,用2-ΔΔCt方法計算CASC11和miR-641表達水平,引物序列見表1。

表1 CASC11和miR-641引物序列

1.7雙熒光素酶報告基因檢測CASC11和miR-641的靶向關系:TargetScan軟件預測CASC11基因3’端含有與miR-641相結合的潛在位點,擴增出含miR-641結合位點的CASC11基因3’端和3’端突變后的UTR序列,構建載體并獲得野生型CASC11(CASC-wt)和突變型CASC11(CASC11-mut)重組質粒,將重組質粒與miR-641 mimic或NC-mimic共轉染至SHG-44細胞,培養48h后,測定熒光素酶相對活性,熒光素酶相對活性=海參熒光素酶活性/螢火蟲熒光素酶活性。

1.8劃痕實驗檢測細胞愈合面積百分比:將細胞制成單細胞懸液,以1×105個/孔的密度接種于6孔板,細胞貼壁后,10μL無菌槍頭均勻劃線,PBS清洗細胞碎片,培養,劃線0h和48h時在顯微鏡下拍照,計算劃痕愈合面積百分比,劃痕愈合面積百分比(%)=(0h劃痕面積-48h劃痕面積)×100%。

1.9Transwell實驗檢測細胞侵襲能力:Transwell上室中鋪滿基質膠,將細胞制成單細胞懸液后每孔接種1×105個細胞,下室中每孔加入600μL培養基,置于培養箱中培養48h,取出小室,PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定,結晶紫染色,顯微鏡下拍照并計數。

1.10蛋白印跡法檢測E-cad、N-cad和vimentin蛋白相對表達量:離心收集細胞,裂解,離心,收集上清,BCA法測定蛋白濃度,煮沸變性。120V電泳1.5h,0.3A濕轉2h,室溫封閉1h,4℃ E-cad、N-cad、GAPDH和vimentin(1∶1000)抗體孵育過夜,TBST洗膜,二抗(1∶5000)室溫孵育1h,TBST洗膜,ECL顯色,Image J分析條帶灰度值,目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值為目的蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1細胞存活率檢測結果:隨八月札水提物濃度的增加,SHG-44細胞的存活率逐漸降低。見表2。

表2 各組細胞存活率比較

2.2qRT-PCR檢測CASC11 和miR-641表達水平結果:與對照組比較,八月札水提物組CASC11表達水平降低,miR-641表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)；與八月札水提物組比較,八月札水提物+CASC11 mimic組CASC11表達水平升高,miR-641 表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)；與NC組比較,CASC11 mimic組CASC11表達水平升高,miR-641 表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)；與CASC11 mimic組比較,八月札水提物+CASC11 mimic組CASC11表達水平降低,miR-641 表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05),對照組和NC組CASC11 和miR-641 表達水平比較,差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

2.3雙熒光素酶檢測結果 CASC11-wt+miR-641 mimic共轉染組細胞熒光素酶相對活性低于NC共轉染組(P<0.05),而CASC11-mut+miR-641 mimic共轉染組和NC共轉染組細胞熒光素酶相對活性差異無統計學意義(P>0.05)。見表4,圖1。

表3 各組細胞中CASC11 和miR-641表達水平比較

圖1 CASC11與miR-641結合位點和突變位點

表4 相對熒光素酶活性比較

2.4劃痕愈合面積百分比檢測結果:與對照組比較,八月札水提物組劃痕愈合面積百分比降低,差異有統計學意義(P<0.05)；與八月札水提物組比較,八月札水提物+CASC11 mimic組劃痕愈合面積百分比升高,差異有統計學意義(P<0.05)；與NC組比較,CASC11 mimic組劃痕愈合面積百分比升高,差異有統計學意義(P<0.05)；與CASC11 mimic組比較,八月札水提物+CASC11 mimic組劃痕愈合面積百分比降低,差異有統計學意義(P<0.05),對照組和NC組劃痕愈合面積百分比比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表5,圖2。

表5 各組劃痕愈合面積百分比比較

圖2 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

2.5侵襲細胞數檢測結果:與對照組比較,八月札水提物組侵襲細胞數減少,差異有統計學意義(P<0.05)；與八月札水提物組比較,八月札水提物+CASC11 mimic組侵襲細胞數增多,差異有統計學意義(P<0.05)；與NC組比較,CASC11 mimic組侵襲細胞數增多,差異有統計學意義(P<0.05)；與CASC11 mimic組比較,八月札水提物+CASC11 mimic組侵襲細胞數減少,差異有統計學意義(P<0.05)；對照組和NC組侵襲細胞數比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表6,圖3。

表6 各組侵襲細胞數比較

2.6蛋白印跡法檢測結果:與對照組比較,八月札水提物組N-cad和vimentin蛋白相對表達量降低,E-cad蛋白相對表達量升高,差異有統計學意義(P<0.05)；與八月札水提物組比較,八月札水提物+CASC11 mimic組N-cad和vimentin蛋白相對表達量升高,E-cad蛋白相對表達量降低,差異有統計學意義(P<0.05)；與NC組比較,CASC11 mimic組N-cad和vimentin蛋白相對表達量升高,E-cad蛋白相對表達量降低,差異有統計學意義(P<0.05)；與CASC11 mimic組比較,八月札水提物+CASC11 mimic組N-cad和vimentin蛋白相對表達量降低,E-cad蛋白相對表達量升高,差異有統計學意義(P<0.05)；對照組和NC組N-cad、vimentin和E-cad蛋白相對表達量比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表6,圖4。

表6 各組細胞中N-cad vimentin和E-cad蛋白相對表達量比較

圖3 Transwell實驗檢測侵襲細胞數

圖4 細胞中各蛋白表達情況

3 討 論

八月札的主要成分為常春藤皂苷,具有廣泛的藥用價值,Zhang等[7]研究表明,常春藤皂苷可改善弓形蟲感染引起的肝損傷。Ma等[8]研究發現常春藤皂苷可抑制博來霉素誘導的肝纖維化。此外,常春藤皂苷具有廣泛的抗腫瘤作用,黃穎等[9]研究表明,常春藤皂苷通過調節內質網相關通路,將骨肉瘤細胞阻滯在G1期,從而誘導癌細胞凋亡。

本研究以膠質瘤細胞SHG-44對研究對象,給予不同濃度八月札水提物處理,結果顯示：細胞存活率隨水提物濃度的升高而降低,提示：八月札水提物可降低膠質瘤細胞的增殖能力。CASC11在多種腫瘤中發揮促癌作用,Yu等[10]研究表明沉默CASC11可抑制新生兒神經母細胞瘤的進展。Yan等[11]報道稱CASC11作為一種致癌基因在非小細胞肺癌中發揮作用。與上述研究結果相一致,本研究上調CASC11表達,膠質瘤細胞侵襲和遷移能力增強,而給予八月札水提物可減弱CASC11表達,降低癌細胞侵襲和遷移能力。miR-641在多種腫瘤中起抑癌作用,Kong等[12]研究表明miR-641作為一種抑癌因子在肺癌中發揮抑癌作用。本研究發現SHG-44細胞中miR-641下調,雙熒光素酶報告基因法證明CASC11直接靶向作用于miR-641,上調細胞中CASC11表達后,miR-641表達下調。結果提示：八月札水提物通過降低CASC11表達,從而上調miR-641表達,在膠質瘤中發揮抑癌作用。

EMT是指在某些因子的刺激下,上皮細胞向間質細胞轉化的現象,與腫瘤細胞的遷移和侵襲密切相關,E-cad在實現細胞間穩定接觸中發揮重要作用,一旦E-cad表達降低,則直接造成細胞間黏附力降低[13]。N-cad和vimentin都是間質細胞標志物,二者表達升高意味著EMT的發生。本研究中CASC11表達上調,可降低細胞中E-cad的表達,同時N-cad和vimentin表達上調,而八月札水提物可改變CASC11的作用,升高E-cad蛋白表達,而降低N-cad和vimentin蛋白表達。結果提示：八月札水提物可逆轉CASC11誘導的上皮間質轉化過程。

綜上所述,八月札水提物可降低膠質瘤細胞SHG-44增殖、遷移和侵襲,其可能是通過調節CASC11/miR-641信號軸逆轉上皮間質轉化過程發揮作用,為臨床治療腦膠質瘤提供理論依據。