黏菌素腎毒性的分子機制及其研究進展

李 萌，沈麟杰，代重山

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

多黏菌素類(Polymyxins)抗生素是一類聚陽離子多肽類藥物，主要包括多黏菌素A、B、C、D、E。黏菌素，也叫多黏菌素E，已被廣泛應(yīng)用于治療革蘭陰性菌造成的動物和人類的腸道及肺部感染，對多重耐藥革蘭陰性細菌(MDR-GNR)感染的治療效果尤為顯著，被稱為治療該類細菌感染的“最后一線治療希望”。目前，如何延長這一臨床上重要的抗菌藥物的使用壽命，已成為一個重要的研究課題，其面臨的主要問題有2個：一個是如何降低其臨床耐黏菌素細菌的發(fā)生概率。近年來，我國已明令禁止將黏菌素作為非治療使用的其他任何用途，明顯地減緩了耐黏菌素細菌的傳播速度，對控制黏菌素的耐藥性做出了積極的貢獻[1]。另一個則是如何降低黏菌素的毒性作用，提高其治療指數(shù)。神經(jīng)毒性和腎毒性是黏菌素臨床應(yīng)用過程中發(fā)生的主要毒副作用，其中腎毒性的發(fā)生率高達60%以上，遠高于其神經(jīng)毒性的發(fā)生率(約7%)，是目前最主要的劑量限制性影響因素，嚴(yán)重降低其臨床治療指數(shù)[2]。因此，迫切需要深入理解和探究黏菌素腎毒性的分子機制，這對黏菌素的安全用藥及減毒策略的開發(fā)均具有重要的科學(xué)意義。因此，本文將對黏菌素腎毒性的分子機制的最新研究進展進行綜述，同時對相關(guān)預(yù)防或改善黏菌素腎毒性的藥物進行歸納總結(jié)，以期為黏菌素的安全用藥及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 黏菌素腎毒性的分子機制研究現(xiàn)狀

1.1 破壞真核細胞的細胞膜結(jié)構(gòu) 已有研究證實，黏菌素誘導(dǎo)腎小管上皮細胞壞死與直接破壞其細胞膜結(jié)構(gòu)相關(guān)，這主要與黏菌素的分子結(jié)構(gòu)所攜帶的D型氨基酸和脂肪酸成分相關(guān)，通過降低細胞漿膜表面張力，造成正常腎小管上皮細胞細胞膜通透性增大，最終導(dǎo)致細胞腫脹和溶解，直至死亡[2]。Dai等[3]研究發(fā)現(xiàn)，雞原代神經(jīng)元細胞暴露于8.3 μg/mL黏菌素24 h后，胞外乳酸脫氫酶(LDH)水平顯著增加。LDH胞外釋放的增加被認為是細胞膜破壞的典型生化標(biāo)志物。相似地，Mingeot-Leclercq等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與黏菌素具有類似結(jié)構(gòu)的多黏菌素B在0.5 mmol/L和1 mmol/L暴露處理豬腎小管上皮細胞(LLC-PK1)48 h時，LDH均顯著增加。這些研究表明黏菌素可破壞真核細胞的細胞膜完整性。通過體外生化試驗發(fā)現(xiàn)，相同劑量的黏菌素對由卵磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇- 4,5-二磷酸等組成的磷脂雙分子層的破壞能力遠大于其他常用的抗菌藥物，如慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素等，表明黏菌素對真核細胞的細胞膜結(jié)構(gòu)具有一定的特異性毒性作用[5]。迄今為止，關(guān)于黏菌素如何作用于真核細胞的細胞膜結(jié)構(gòu)，如何破壞其完整性，確切的分子機制尚不清楚，這些問題仍有待進一步研究。

1.2 誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激損傷 氧化應(yīng)激是指機體由于受到內(nèi)源性或外源性刺激，使得體內(nèi)氧化與抗氧化作用間的平衡失常，自由基產(chǎn)生過多，如活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而引發(fā)的一系列應(yīng)激反應(yīng)。

ROS常包括過氧化氫(H2O2)、超氧自由基(O2·-)、羥基自由基(·OH)和單線態(tài)氧(1O2)等自由基。體外多個細胞研究證實，黏菌素暴露可誘導(dǎo)小鼠原代神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)瘤Neuro-2a(N2a)、大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)、人腎臟細胞(HK-2)、雞原代神經(jīng)元細胞內(nèi)ROS大量釋放，ROS的過多積累導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化損傷蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)等細胞內(nèi)大分子，最終導(dǎo)致細胞死亡[3,6-11]。本課題組前期研究證實，小鼠靜脈注射7.5 mg/(kg·bw·d)和15 mg/(kg·bw·d)黏菌素，連續(xù)注射7 d后，小鼠腎臟組織中脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物丙二醛(MDA)含量顯著升高，抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)活性及谷胱甘肽(GSH)含量顯著降低[8]。在細胞內(nèi)，SOD主要用于清除O2·-，CAT主要用于清除·OH，GSH主要用于清除H2O2，這些抗氧化蛋白在細胞內(nèi)的降低將加劇其氧化-抗氧化系統(tǒng)的失衡，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷[7]。這些研究均表明，ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷在黏菌素誘發(fā)的腎毒性中扮演著重要角色。

一些研究發(fā)現(xiàn)，黏菌素也可誘導(dǎo)RNS的過量產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷[11-12]。RNS包括一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)和過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)等自由基。體外研究證實，375 μmol/L多黏菌素B處理LLC-PK1細胞72 h，顯著上調(diào)NO的釋放[13]。Ozkan等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在黏菌素誘導(dǎo)的大鼠腎損傷模型中，腎組織中的SOD活力顯著降低，誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)及內(nèi)源性一氧化氮合酶(eNOS)均顯著升高。iNOS或eNOS表達和活性的增加，將促進L-精氨酸(L-Arg)產(chǎn)生NO，過多的NO將直接導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷。

目前，研究者對黏菌素誘導(dǎo)的ROS或RNS過量產(chǎn)生的分子機制尚不清楚。最新研究發(fā)現(xiàn)，黏菌素可通過上調(diào)細胞內(nèi)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)的產(chǎn)生，從而促進細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)腎細胞氧化應(yīng)激損傷[6]。Wang等[14]最新研究發(fā)現(xiàn)，METTL3介導(dǎo)的N6-甲基腺苷(m6A)修飾通過調(diào)控miRNA-873-5p表達，從而影響?zhàn)ぞ卣T導(dǎo)的氧化應(yīng)激及腎毒性。然而，線粒體作為細胞內(nèi)ROS的主要來源，黏菌素誘導(dǎo)的ROS過量產(chǎn)生是否與線粒體呼吸鏈的傳遞遭到破壞直接相關(guān)，仍有待進一步的研究。

1.3 誘導(dǎo)細胞凋亡 凋亡是一種細胞程序化死亡，涉及內(nèi)源性及外源性凋亡途徑，主要包括線粒體、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[8,15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠靜脈注射15 mg/(kg·bw·d)黏菌素，連續(xù)注射7 d后，小鼠腎臟組織中B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)顯著降低，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、細胞色素C(CytC)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-9和Caspase-3等蛋白表達顯著增加，這表明線粒體凋亡途徑參與黏菌素誘導(dǎo)的小鼠腎毒性，同時也證明，Caspase依賴及非依賴性凋亡均參與黏菌素誘導(dǎo)的細胞凋亡；小鼠腎臟組織中Fas細胞表面死亡受體(FAS)、FAS配體(FASL)、FAS相關(guān)死亡域蛋白(FADD)、Caspase-8及其剪切體表達顯著增加，表明死亡受體凋亡途徑參與黏菌素誘導(dǎo)的細胞凋亡；小鼠腎臟組織中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Grp78)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)及其剪切體、生長抑制和DNA損傷誘導(dǎo)基因153(GADD153/CHOP)和Caspase-12的表達顯著增加，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑參與黏菌素誘導(dǎo)的腎細胞凋亡[8]。

調(diào)控細胞凋亡涉及多個信號通路。有文獻已證實，在黏菌素誘導(dǎo)的小鼠腎毒性過程中，磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路、核因子κB(NF-κB)信號通路、核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/單加氧酶(HO-1)信號通路、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號通路等多種信號通路被激活[8,16]。然而，目前尚不清楚這些信號通路的激活在黏菌素誘導(dǎo)的腎毒性過程中發(fā)揮何種角色，是否與黏菌素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及線粒體功能失調(diào)直接相關(guān)，均有待進一步的探究。

1.4 誘導(dǎo)細胞自噬 動物模型研究證實，在黏菌素誘導(dǎo)的腎毒性模型中，自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達顯著增加，使用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞中可以明顯觀察到自噬體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)[8]，表明黏菌素腎毒性過程中可能激活腎臟上皮細胞內(nèi)的自噬反應(yīng)。作為一種自我降解過程，自噬可以由ROS或營養(yǎng)缺失脅迫引起，自噬往往與細胞凋亡作用相反，其能夠消除錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)，清除受損細胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過氧化物酶體等亞細胞器，從而促進細胞存活[17]。Dai等[18]通過體外細胞試驗證實，將轉(zhuǎn)入GFP-LC3質(zhì)粒的N2a細胞經(jīng)100 μmol/L黏菌素處理24 h后，綠色熒光斑點顯著增多，表明自噬被激活；同時，在細胞內(nèi)也可觀察到明顯的自噬小體、自噬溶酶體等; 在使用自噬抑制劑氯喹處理后，顯著加劇黏菌素誘導(dǎo)的N2a細胞凋亡，而自噬激活劑雷帕霉素明顯改善黏菌素誘導(dǎo)的N2a細胞氧化應(yīng)激損傷及細胞凋亡。

通過調(diào)控細胞自噬控制藥物毒副作用、細胞衰老及感染性疾病已被廣泛研究。自噬、氧化應(yīng)激和細胞凋亡三者之間既相互依存，又相互調(diào)控，涉及多個信號通路。先前的研究已經(jīng)證實，p53信號通路、mTOR/ULK1信號通路、JNK信號通路和PI3K/Akt信號通路參與黏菌素誘導(dǎo)的細胞自噬[18-20]。但目前對這些信號通路的激活如何調(diào)控黏菌素誘導(dǎo)的細胞自噬，在黏菌素誘導(dǎo)的細胞自噬、氧化應(yīng)激和細胞凋亡等諸多信號網(wǎng)絡(luò)過程中發(fā)揮怎樣的角色，仍然存在諸多疑問。因此，研究黏菌素誘導(dǎo)的細胞自噬仍然是十分重要的科學(xué)問題。

1.5 誘導(dǎo)細胞周期阻滯 體外細胞及動物試驗證實，黏菌素可誘導(dǎo)腎細胞S期阻滯[21]。細胞周期的進展和停滯過程與腎損傷后腎臟的恢復(fù)和纖維化密切相關(guān)。p21蛋白(CDKN1a)是細胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)的抑制劑，在凋亡過程中發(fā)揮重要作用，可依賴或非依賴于p53蛋白的控制[21]。目前，p21蛋白介導(dǎo)的細胞周期阻滯在黏菌素誘導(dǎo)的腎毒性中發(fā)揮的作用尚不清楚，仍有待進一步研究。

2 黏菌素腎毒性的減毒策略

2.1 通過改變黏菌素劑型或抑制細胞攝取降低黏菌素腎毒性 臨床中，黏菌素主要用于治療胞外菌感染，而黏菌素誘導(dǎo)腎毒性的直接原因是腎細胞內(nèi)藥物濃度過高，超過耐受閾值。因此，不減少血藥濃度及其殺菌活性的情況下，降低真核細胞內(nèi)的黏菌素藥物濃度是有效的減毒策略之一。目前，臨床已經(jīng)采取霧化給藥方式治療肺部感染，從而達到降低黏菌素系統(tǒng)毒性的目的[22]。還有一些研究通過抑制黏菌素的受體活性改善黏菌素的細胞內(nèi)攝取，從而達到降低黏菌素腎毒性的目的[23]。多個研究證實，內(nèi)源性受體巨蛋白(MR)、多肽轉(zhuǎn)運蛋白1(PEPT1)及有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白1(OCTN1)是多黏菌素類藥物進入細胞內(nèi)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白[23-25]。動物模型發(fā)現(xiàn)，細胞色素C(CytC)可通過抑制MR活性明顯改善多黏菌素B誘導(dǎo)的大鼠腎毒性[26]。離子通道轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑糖蛋白預(yù)處理也可改善黏菌素誘導(dǎo)的細胞凋亡及腎臟損傷[27]。然而，由于這些受體自身也具有重要的生物學(xué)功能，受體抑制劑的使用導(dǎo)致對其他功能的損傷，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。

2.2 抗氧化劑抑制黏菌素腎毒性 基于上述的氧化應(yīng)激損傷理論，開發(fā)有效的抗氧化劑是目前針對黏菌素腎毒性的重要減毒策略之一。多項研究通過小鼠及大鼠模型研究證實，傳統(tǒng)的抗氧化劑，如維生素C、維生素E、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、褪黑素和α-硫辛酸，這些藥物自身具有較強的抗氧化功能，用藥后能夠部分改善黏菌素誘導(dǎo)的腎臟組織氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡，從而改善黏菌素誘導(dǎo)的腎毒性[7,10,28-33]。然而，臨床研究顯示，維生素C的使用未能有效改善黏菌素臨床應(yīng)用的腎毒性，這提示傳統(tǒng)的抗氧化劑僅在動物模型上具有一定的保護效果，主要原因可能與動物模型使用劑量遠高于臨床實際使用劑量或二者之間的生理差異相關(guān)[33]。此外，維生素C與黏菌素同時給藥可能影響?zhàn)ぞ氐乃巹訉W(xué)，也可能抑制黏菌素的抗菌活性，因而在臨床應(yīng)用上極其受限。

2.3 激活Nrf2/HO-1信號通路改善黏菌素腎毒性 Nrf2是細胞內(nèi)最重要的調(diào)控抗氧化應(yīng)激損傷的轉(zhuǎn)錄因子之一，Nrf2激活可促進其下游抗氧化元件(ARE)相關(guān)基因的表達，如促進HO-1、SOD和GSH-Px的表達。這些基因的激活常常可通過清除細胞內(nèi)ROS水平，達到抑制氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡，從而改善黏菌素腎毒性的目的。如Dezoti Fonseca等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HO-1誘導(dǎo)劑血紅素能夠增加腎臟組織內(nèi)過氧化氫酶活性，保護多黏菌素B誘發(fā)的小鼠腎毒性。本課題組先前的研究證實，小鼠口服補充番茄紅素20 mg/(kg·bw·d)、黃芩素100 (kg·bw·d)或姜黃素200 (kg·bw·d)，連續(xù)7 d，均可有效激活Nrf2/HO-1信號通路，從而改善黏菌素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷及腎毒性[25,34]。值得注意的是，這些天然活性物質(zhì)往往具有較高的臨床安全性，且來源較為豐富，價格相對低廉，在獸醫(yī)臨床更具有應(yīng)用價值。此外，一些化合物，如姜黃素，還可有效改善黏菌素誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，協(xié)同黏菌素體外殺菌，逆轉(zhuǎn)耐藥菌對黏菌素的敏感性，具有較強的臨床開發(fā)價值[25]。

3 總結(jié)與展望

黏菌素已成為臨床治療多重耐藥革蘭陰性細菌造成感染的最重要的抗菌藥物之一。腎毒性是黏菌素臨床應(yīng)用的主要毒副作用，嚴(yán)重限制其劑量應(yīng)用及臨床治療指數(shù)。同時，越來越多的研究表明，增加當(dāng)前推薦的臨床治療劑量可能會達到更好的治療效果，并且可降低臨床細菌產(chǎn)生適應(yīng)性耐受的風(fēng)險，但增加劑量往往會增加其腎毒性和神經(jīng)毒性。經(jīng)過十余年的研究，關(guān)于黏菌素腎毒性的分子機制已經(jīng)取得了一定的進展，已經(jīng)證實黏菌素可誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激、凋亡及自噬，而氧化應(yīng)激損傷在黏菌素腎毒性過程中發(fā)揮重要作用，抑制氧化應(yīng)激能夠在一定程度上緩解黏菌素誘導(dǎo)的細胞死亡和腎毒性。同時，研究也發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt、NF-κB、Nrf2/HO-1、MAPK、p53及p21等多個信號通路參與調(diào)控黏菌素誘導(dǎo)腎毒性。然而，尚不清楚這些信號通路在黏菌素腎毒性過程中的內(nèi)在聯(lián)系，它們?nèi)绾斡绊懷趸瘧?yīng)激，如何調(diào)控細胞自噬及凋亡，是否可以作為靶點來抑制黏菌素腎毒性，這些問題均亟待解決，對降低黏菌素的腎毒性，開發(fā)有效的減毒策略，提高臨床治療指數(shù)具有重要的科學(xué)意義。