流式細胞術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤治療中的應(yīng)用價值

鄧 娜，吳冠宇，楊 柳，谷和先，盛德菁，周 娜，王何懼

（馬鞍山市人民醫(yī)院血液科，安徽 馬鞍山 243000）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma）是血液科常見疾病之一，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢[1-3]。既往多發(fā)性骨髓瘤的診斷主要依賴于骨髓細胞學、血清蛋白電泳、臨床表現(xiàn)及影像學改變，診斷水平相對較低，同時難以與其他漿細胞病相鑒別。近年來，流式細胞術(shù)已成為多發(fā)性骨髓瘤診斷和分型的重要依據(jù)，其能快速、準確、客觀地反映多發(fā)性骨髓瘤細胞的生物學特性，鑒別多發(fā)性骨髓瘤及其他漿細胞病，并能用于治療后多發(fā)性骨髓瘤微小殘留病（minimal residual disease，MRD）的監(jiān)測，提高診斷水平，進而指導臨床治療[4-6]。有研究表明[7]，二代流式細胞術(shù)能增強MRD 的檢出率。目前，治療后的免疫表型分析已被納入多發(fā)性骨髓瘤新的療效評價標準。基于此，本研究旨在分析多發(fā)性骨髓瘤表型的特點及其在疾病不同分期和分型中的差異，分析其與骨髓細胞學等監(jiān)測手段之間的相關(guān)性，進一步評價流式細胞術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤診治中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年4 月-2020年3 月在馬鞍山市人民醫(yī)院血液科住院的初診多發(fā)性骨髓瘤患者34例為研究對象，其中男22例，女12例，年齡48～88歲，中位年齡75歲。所有初診患者均完善骨髓形態(tài)（包含組化染色）、流式免疫分型、骨髓活檢、血尿免疫固定電泳及必要的影像學檢查，符合多發(fā)性骨髓瘤分型診斷標準（國際骨髓瘤工作組診斷標準-2014 修訂版）[5]。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 采集初診多發(fā)性骨髓瘤患者新鮮骨髓液，調(diào)整細胞數(shù)至（0.5～1.0）×106個/ml，使用BD FACSCalibur 流式細胞儀及其配套試劑（試劑均購自美國Becton Dickinson 公司，試劑批號：347193、341025、31096、652814、652803）以及雙激光四色流式細胞分析儀檢測胞膜抗原。每管取100 μl 樣本加不同組合抗體各20 μl，同時做同型對照管，混勻，避光20 min，溶血后上機檢測分析，每管至少獲取10 000個細胞。使用CD45/SSC 進行設(shè)門，對CD38、CD138、CD19、CD56、CD20、CD28、CD117、CD9、CD10、CD33、Cyκ、Cyλ 表型的表達進行分析。流式圖中用10 的指數(shù)來表示抗原表達強弱，設(shè)十字門，表達抗原細胞≥20%判定為陽性，≥80%判定為強陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以（n，%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 精確概率法。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞學表型特點 CD38、CD138 陽性率均為100.00%；CD45 陽性率為5.88%，其中1例患者異常細胞群表達CD45；另1例患者有2 群異常細胞，其中一群細胞表達CD45，一群不表達，見表1。

表1 34例患者異常細胞群流式免疫表型表達（n，%）

2.2 流式免疫表型與多發(fā)性骨髓瘤分型的關(guān)系CD45、CD38、CD19、CD56、CD20、CD28、CD117、CD9、CD23 的表達與疾病分型無關(guān)（P＞0.05），CD33 的表達與疾病分型有關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 不同疾病分型的表型差異[n（%）]

2.3 流式免疫表型與多發(fā)性骨髓瘤分期的關(guān)系CD45、CD38、CD56、CD20、CD28、CD117、CD9、CD23、CD33 的表達與ISS 分期無關(guān)（P＞0.05），CD19 的表達與ISS 分期有關(guān)（P＜0.05），見表3。

表3 不同分期的表型差異[n（%）]

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤系血液系統(tǒng)惡性疾病之一，由于體內(nèi)漿細胞惡性增殖產(chǎn)生異常免疫球蛋白而致病。近年來該疾病發(fā)病率呈上升趨勢，多發(fā)于中老年人，男性發(fā)病率高于女性，也是一種不可治愈的惡性血液病[4]。流式細胞術(shù)是一種在溶液中對單個細胞進行快速多參數(shù)分析的技術(shù)，其作為檢測工具，在過去的30年里取得了巨大的進步，使免疫系統(tǒng)和細胞生物學其他領(lǐng)域的研究獲得了較大突破[5]。隨著近年來多發(fā)性骨髓瘤診斷的不斷更新，骨髓細胞學中原幼漿細胞比例對于診斷的意義在不斷減弱，而更加看重克隆性漿細胞的占比[8]，且骨髓細胞學的主觀形態(tài)檢查已經(jīng)無法滿足新診斷標準，因此免疫分型的應(yīng)用更加廣泛。

CD38、CD138 作為漿細胞的主要標志，其在本研究中陽性率均為100.00%；CD45 弱表達在本研究中占比僅5.88%，但依靠這3 種免疫表型缺乏特異性，很難與正常漿細胞區(qū)分，仍需要結(jié)合其他的免疫表型進行臨床診斷。CD19 和CD56 可區(qū)分免疫表型正常和病理漿細胞[9]。既往對多發(fā)性骨髓瘤異常免疫表達的研究中也將CD19 和CD56 作為區(qū)分異常漿細胞的主要表型[10，11]。

本研究結(jié)果顯示，CD28 陽性率為28.41%，CD117 陽性率為41.18%。CD28 是T 淋巴細胞表面表達的共刺激分子，對T 細胞的活化起到重要作用，其表達被認為與增殖活性增強及骨髓、器官、組織的侵入以及高風險的細胞遺傳學異常有關(guān)，可以使多發(fā)性骨髓瘤細胞產(chǎn)生生長因子，降低腫瘤細胞的凋亡，并且可導致免疫細胞異常，為多發(fā)性骨髓瘤的免疫治療提供了新的靶點[12，13]。CD117 又稱c-kit，是具有酪氨酸激酶活性的造血生長因子，在正常漿細胞上表達缺失，異常表達于惡性漿細胞表面。在多發(fā)性骨髓瘤患者中，CD117 的表達是提示疾病早期和預(yù)后較差的指標之一[14-16]。

本研究結(jié)果顯示，CD20 陽性率為8.82%，CD9陽性率為41.18%，CD23 陽性率為2.94%，CD33 陽性率為17.65%。CD20 表達于除漿細胞（分泌免疫球蛋白的B 細胞）外的發(fā)育分化各階段B 細胞的表面，通過調(diào)節(jié)跨膜鈣離子流動直接對B 細胞起作用，在B 細胞增殖和分化中起重要的調(diào)節(jié)作用。CD20 在多發(fā)性骨髓瘤表達率偏低，因CD20 陽性骨髓瘤細胞具有異質(zhì)性的臨床特征、細胞形態(tài)、免疫表型和細胞遺傳學特征,因此對于常規(guī)治療后的預(yù)后影響不大[17]。CD9 有多種生物學功能，其在細胞黏附、細胞運動、激活、分化、腫瘤轉(zhuǎn)移以及精卵融合等方面都發(fā)揮著重要的作用；并與多發(fā)性骨髓瘤的活動與否有關(guān)，與生存預(yù)后關(guān)系不大。CD23 是一種低親和力IgE 受體,主要表達于成熟的B 細胞和濾泡樹突狀細胞，可用于標記生發(fā)中心的活化B 細胞，在多發(fā)性骨髓瘤中表達偏低。CD33 是髓系細胞分化抗原，主要分布在髓系血細胞，特別是在分化的早期階段。研究表明[18]，多發(fā)性骨髓瘤中CD33 陽性率為10%～25%往往提示預(yù)后不良，化療和復(fù)發(fā)可以增加CD33 在多發(fā)性骨髓瘤中的表達。

此外，本研究中Cyκ、Cyλ 的陽性率分別為58.82%、41.18%，這與國內(nèi)學者[19，20]提出輕鏈的同型排斥理論相符，即一個克隆的漿細胞只表達一種輕鏈，漿細胞惡性轉(zhuǎn)化后，Ig 合成異常，尤以單一成分的輕鏈合成過量為突出表現(xiàn)。作為鑒別正常與異常漿細胞表型的重要標志，胞漿輕鏈的表達在多發(fā)性骨髓瘤的診斷中具有重要作用[21，22]。本研究中依據(jù)差異性分析，不同分期及分型之間免疫表型大部分呈一致性，部分有差異的表型可能與本研究中病例數(shù)較少，并且分型集中于IgG 型、分期集中于Ⅲ期有關(guān)。因此，今后有待擴大樣本量后再驗證表型差異的可靠性。

綜上所述，免疫表型的分析更符合診斷標準，能更準確的區(qū)分良、惡性漿細胞，對于多發(fā)性骨髓瘤的預(yù)后及治療后的監(jiān)測均有意義。