C C L2 調節血管生成及在骨重建修復中的運用

彭中華，彭詩婷，龐 河，彭 鑫，譚奇超，魏 波

（1.廣東醫科大學研究生院，廣東 湛江 524023；2.中山大學附屬第五醫院婦產科，廣東 珠海 519000；3.廣東醫科大學附屬醫院骨科，廣東 湛江 524023）

隨著社會經濟及交通事業的快速發展，高處墜落、車禍等高能量創傷造成的復雜性骨折頻發，骨折類型以開放性、粉碎性為主，創傷后易造成骨愈合不良、骨不愈合[1]，盡管骨組織在體內可完全再生，但超過臨界長度的骨缺損難以自行修復與重建[2]，漫長的康復過程給患者造成巨大的身體、經濟及心理負擔，因此備受關注。快速修復巨大骨創傷缺損成為當前研究的重點和難點。在體內，趨化因子CC 基序配體2（CCL2）可由許多不同類型的細胞在氧化應激之后產生，可以促進血管新生、干細胞遷移、骨組織形成，加速骨的缺損修復等，對應用CCL2 促進骨的快速修復重建提供了新的思路。本文現對CCL2 促血管生成的作用機制及其在骨重建修復中的應用綜述如下，旨在為CCL2 在骨折愈合中的應用研究及治療研究提供參考。

1 CCL2 的介紹

趨化因子CC 基序配體2（CCL2）又稱為單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1），是CC-基序趨化因子家族的成員之一。CCL2 是第1個發現的人類趨化因子，也是單核細胞的有效趨化因子[3]，同時還具有促炎和抗炎的作用[4]，是涉及對炎癥部位招募和轉運單核免疫細胞的小趨化因子[5]。趨化因子是可以調節特定白細胞亞群的趨化性和代謝活性的低分子量分泌蛋白，是一個大家族的小分泌蛋白，其信號通過細胞表面G 蛋白偶聯的七肽趨化因子受體，具有刺激細胞遷移的能力，白細胞尤甚。因此，趨化因子在免疫系統的發育和穩態中起著核心作用，并參與所有保護性或破壞性免疫和炎癥反應。除了誘導細胞停滯或粘附之外，趨化因子還可以刺激其他類型的定向和非定向遷移行為[6]。CCL2 是CC 趨化因子受體2（CCR2）的配體，對單核細胞/巨噬細胞和活化的T細胞具有趨化作用[7]。CCL2 由許多不同的細胞類型在氧化應激之后產生或誘導后表達，包括內皮細胞、上皮細胞、平滑肌、系膜細胞、星形細胞、單核細胞、骨髓細胞、小膠質細胞和成纖維細胞等[8]，是單核細胞、嗜堿性粒細胞、T 淋巴細胞和NK 細胞等細胞的有效化學誘導物；趨化因子與其同源受體的結合是觸發信號轉導途徑和發揮趨化性等生物學效應的必要途徑。CCL2 介導其通過CCR 的作用，主要是CCR2，與CCL2 不同，CCR2 表達主要限于血管平滑肌細胞、單核細胞和自然殺傷（NK）細胞[9]。

2 CCL2 的主要功能

2.1 CCL2 與血管生成、創面愈合 CCL2 對血管生成起著重要作用，但其中的機制機制尚不十分明確。研究表明[10]，CCL2 參與了新血管生成的發生，包括單核巨噬細胞的募集和靶細胞分泌細胞因子的調節，CCL2 通過CCL2-CCR2 信號軸調節巨噬細胞的浸潤，在新血管生成中起關鍵作用。巨噬細胞可以通過清除細胞碎片、破壞入侵的病原體、產生大量細胞因子、趨化因子和生長因子來促進愈合過程。趨化因子是調節靶細胞遷移的小信號分子家族的成員，CCL2 通過與其同源受體CCR2 或CCR4 結合，激發單核細胞/巨噬細胞的趨化潛能，這些細胞因子可以促進新血管生成，而新血管生成是傷口愈合、組織生長的必要過程。血管生成，即從現有血管中形成新生血管，是由血管生成和血管抑制性細胞因子精確控制的。所募集的巨噬細胞或駐留的巨噬細胞根據特定的微環境與趨化因子結合后遷移到病損部位[11]，促進血管生成。在新血管生成過程中，CCL2 直接促進血管內皮的遷移，巨噬細胞在CCL2 的刺激下，能夠分泌多種促血管生成細胞因子如VEGF-A、IFN-γ 和IL-6，直接增強血管生成作用[12]，其中VEGF-A 是參與愈合過程的最重要的促血管生成因子之一。巨噬細胞的特征在于其表型擁有不同的屬性，在特定的微環境可誘導分化成獨特的亞型，當被不同類型的趨化因子如CCL2、CCL5 和CX3CL1 募集時，巨噬細胞可釋放一系列血管生成或血管生成抑制因子，如VEGF-A、THBS-1 和ADAMTS-1，使細胞因子的表達朝向促血管生成或抗血管生成方向傾斜[13]。

還有相關文獻報道，CCL2 通過上調低氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達水平，促進人臍靜脈和皮膚內皮細胞的血管形成[14]，在體外同樣能夠促進人臍靜脈內皮細胞毛細血管樣結構的形成。機體內分泌的CCL2通過向內皮細胞募集平滑肌細胞，參與介導組織因子的血管生成作用，并促進體內基質膠栓新生微血管的成熟。有學者利用CCL2 改善小鼠后肢缺血模型中的血流情況[15]，證明了CCL2/CCR2 信號軸在內皮細胞的遷移和新血管生成中的關鍵調節作用，并能促進血流的恢復。也有學者發現[16]，間充質干細胞來源的CCL2 能夠加速創面閉合，在促進血管生成、上皮再生和減輕炎癥反應、加速皮膚創面愈合起著重要作用。同時，CCL2 也可通過與其特異性受體CCR2 結合，在乳腺癌組織中可促進血管形成[17]。Ishida Y 等[18]在構建糖尿病小鼠皮膚缺損模型中發現，對照組在切除皮膚后出現愈合障礙，新血管生成、CCL2 的表達和巨噬細胞浸潤減少，實驗組外用CCL2 提取物涂層即可逆轉損傷后皮膚的愈合，提高傷口愈合率、促進新血管生成、膠原積聚，促進血管內皮生長因子和轉化生長因子-β 表達及巨噬細胞浸潤等，因而可知局部應用CCL2 可以成為治療創面修復缺陷、促進皮膚創面新血管生成和膠原沉積的有效方法。

2.2 CCL2 與炎癥浸潤、細胞遷移 CCL2 是一種特異性因子，能夠吸引、激活單核細胞和巨噬細胞，是受體CCR2 的主要配體。趨化因子通過與CCR2 趨化因子受體的相互作用，介導單核細胞從骨髓中分離并募集到炎癥組織中，促炎細胞因子可上調其表達。CCL2-CCR2 軸通過影響功能相關和極化相關基因的表達，下調促炎性細胞因子的產生調節巨噬細胞的極化[19]。PI3K 和MAPK 信號通路參與細胞存活、生長和侵襲的調控，CCL2 可通過激活Akt 和MAPK/Erk1/2 信號通路，增加增殖細胞核抗原、Survivin 和基質金屬蛋白酶2 的表達，降低金屬蛋白酶組織抑制因子1 和2 的表達，促進胚胎干細胞的存活、增殖和遷移，除了在炎癥反應中的作用外，CCL2 還通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信號通路（5-7）上調Survivin 的表達，進一步刺激細胞的增殖和存活。抗CCL2 中和抗體和CCR2 拮抗劑可以完全降低CCL2 誘導的胚胎干細胞的存活率、增殖率和侵襲力[20]。

研究表明[21]，趨化因子成員CCL2、CCL7、CCL8、CCL12 和CCL13 都能與趨化因子受體CCR2 結合，但CCL2/CCR2 被認為是單核/巨噬細胞遷移和浸潤的最有效的介質，通過CCR2 受體，CCL2 誘導炎性單核細胞/巨噬細胞向外周組織的遷移。CCL2 具有幾種血管生成特性，可以通過CCR2 誘導內皮細胞增殖和遷移[22]，CCL2 通過誘導促炎因子的表達和募集巨噬細胞，在病變形成中發揮作用[23]。在創傷愈合過程中，巨噬細胞的浸潤受到過度增殖的角質形成細胞、成纖維細胞和其他巨噬細胞釋放的CC-趨化因子的高度調節，CCL2 在傷后第1周內表達的多種趨化因子表達比例最高。趨化因子調節關鍵的血管生成過程，如炎癥細胞向損傷部位的募集，為增殖和遷移細胞提供支持，并形成肉芽組織；可見CCL2具有顯著刺激內皮細胞血管形成和遷移的能力[24]。CCL2 及其受體CCR2 同時是參與腫瘤微環境的主要趨化因子，通過調節巨噬細胞的動員和浸潤，從骨髓募集單核細胞到周圍炎癥部位；且CCL2-CCR2軸可以通過激活ERK1/2-MMP2/9 途徑促進細胞的轉移[25]。有學者發現[26]，過表達CCL2 的骨髓間充質干細胞（MSCs）能夠修復SD 大鼠腦卒中模型的功能缺陷，這是由于腦梗死區CCL2 水平升高導致干細胞的遷移頻率增加，從而促進血管生成和神經發生，減少神經炎癥，恢復神經的功能。

3 骨重建再生與血管生成

骨是一種高度血管化的組織，具有獨特而復雜的結構。長骨由包含血管滲透通道網絡的外周皮質外殼和高度血管化的內部骨髓間隙組成[27]。生理骨質的重塑是具有生長、修復和礦物質穩固的作用[28]。長骨骨折的愈合是一個復雜的動態過程，包括炎癥機化、修復和塑形改造3個主要階段。在炎癥機化階段，血管將包括血小板、中性粒細胞和巨噬細胞在內的免疫系統細胞運送到損傷部位，這些細胞被激活，以釋放炎癥細胞因子來吸引其他細胞。在修復過程中，骨膜細胞在創面遷移分化成軟骨細胞，形成骨痂，隨后基質鈣化，血管生成，軟骨細胞被成骨細胞取代。最后，致密的骨通過重塑形成，成骨細胞成熟為破骨細胞。其中血管被認為是啟動骨折愈合的關鍵因素，在細胞遷移、增殖和早期分化中起關鍵作用。血管生成的過程在很大程度上是通過內皮細胞將現有血管萌發到缺氧區，再由內皮細胞排列并連接到現有血管。

骨組織的再生基于成骨和血管生成過程之間相互作用，能夠驅動骨生長和組織修復。骨再生的成敗取決于血管化過程的中心作用，尤其是血管化的可能性是骨再生的關鍵。血管的生成為組織修復提供足夠的營養、生長因子、礦物質和氧氣，血管形成是骨形成、骨骼發育和骨整合過程中必不可少的組成部分，在生長因子轉運中起著關鍵作用，使細胞能夠存活和相互作用。骨脈管系統在骨構建，新的血管生長在原發性骨發育以及成人骨折修復過程中都是必不可少的。骨修復和骨重塑都涉及血管生成和成骨途徑之間的激活和相互作用[29]。骨血管生成不足或不合適與骨形成減少有關[30]，血管系統的不利影響直接抑制骨組織的再生，延遲骨的愈合[31]。

CCL2 在骨重塑和骨骼轉移的機制中起關鍵作用。CCL2 通過其對單核細胞募集，激活血源性相關巨噬細胞，誘導血管生成，促進轉移和骨質細胞發生的影響。CCL2 通過CCR2 作用于血管內皮細胞，刺激血管內皮生長因子-A（VEGF-A）的釋放實現血管生成[9]。血源性巨噬細胞是從單核細胞中產生的，單核細胞從血液中吸收到組織部位后成熟，這些單核細胞和/或巨噬細胞通過多種趨化因子吸收，CCL2-CCR2 信號軸對損傷后巨噬細胞向炎癥部位的募集[32]促進血管的生成。在骨組織工程中，人骨髓間充質干細胞（HMSCs）通常被用作成骨細胞和再生骨的骨祖細胞，而內皮細胞（ECs）通常用于血管生成，干細胞是CCL2 相對主要的來源，通過CCL2/CCR2 軸傳遞基本信號，招募巨噬細胞聚集炎癥部位，釋放血管內皮生長因子，以實現血管生成對細胞的增殖和隨后組織的再生[33]。使用HMSCs 的一個主要優點是，其內源性血管生成細胞因子的產生消除了外源性治療可溶性因子的需求，這些治療可溶性因子在體內和體外均能穩定內皮細胞形成的血管結構，抑制內皮細胞凋亡，誘導非靶向組織中的血管生成，刺激細胞增殖生長，促進功能血管的發展[25]，以促進骨創傷的重建愈合。另外，CCL2 通過參與破骨細胞的分化和成熟參與骨的再建，通過應力骨折（SFx）啟動特異性誘導，激活SFx 的靶向重塑，并在SFx 的骨膜出口處由成骨細胞和骨細胞表達[34]。Sumi K 等[35]利用RAW264 細胞系作為破骨細胞祖細胞的模型，發現間充質干細胞通過CCR2 產生CCL2 作為破骨細胞祖細胞的趨化信號。因此，認為CCL2 是破骨細胞生物學的調節劑，具有促進細胞生存和促成骨分化的作用，參與骨的重建，尤其是破骨細胞的分化。

4 總結

CCL2 對于巨噬細胞的聚集、新生血管的生成、組織細胞的遷移、骨組織的再生等作用雖然已有初步的確定，但其中包含的具體機制非常復雜，且CCL2 對于骨缺損修復在臨床上的應用較少。CCL2對骨重建修復的有效使用劑量，以及具體通過哪些信號通路發生作用尚不清楚，甚至可能存在藥物劑量的依賴性以及時效作用性，其他趨化因子也可能對CCL2 存在協同或者拮抗的效應，如能提高及精準地利用CCL2 的效能對臨床上促進骨創傷缺損的快速修復與重建有著較好的前景。