miR-146a/b 在慢性阻塞性肺疾病患者血清中的表達及相關性分析

葛 飛，孟凡亮

（安徽醫科大學附屬巢湖醫院呼吸內科，安徽 合肥 238000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種與老齡化和吸煙相關的氣流不可逆受限為特征的疾病，到2030年，慢性阻塞性肺疾病將成為全球第3 大死因，目前發展中國家患病率仍在上升[1]。近年來，由于其高死亡率和致命的共病[2]，引起了越來越多的關注，且慢性阻塞性肺病在老年人中診斷過度，在成人中診斷不足，因此需要尋找一種有效診斷慢性阻塞性肺疾病的方法。微小核糖核酸（miRNAs）是一個不斷增長的小非編碼核糖核酸家族，通過與靶向信使核糖核酸（mRNAs）的3 非翻譯區（3UTR）結合來調節基因表達[3]。通過改變miRNAs 的表達來調節細胞活動[4]，如增殖、凋亡、分化，其與腎臟疾病、心血管功能障礙、肺部疾病和癌癥等多種疾病的發生有關[5-8]。慢性阻塞性肺疾病與有毒氣體或香煙煙霧的慢性炎性反應增強有關[9]，降鈣素原（PCT）、C 反應蛋白（CRP）、血沉（ESR）可準確反映慢阻肺患者體內炎癥反應的嚴重程度，是了解患者病情變化的主要實驗室指標[10]。因此，本研究分析了三組miR-146a/b 相對表達量的差異，及其與上述指標的相關性，評價其臨床價值與意義，旨在為該病的診斷提供參考，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1 月-11 月安徽醫科大學附屬巢湖醫院急性加重期慢阻肺（AECOPD）患者90例，穩定期慢阻肺（stable COPD）患者90例。另選取在安徽醫科大學附屬巢湖醫院進行健康體檢，且年齡、性別與全部慢阻肺患者相匹配的健康體檢者90例設為對照組。按照2020年慢性阻塞性肺疾病GOLD 指南，把急性加重期組分為GOLD2 級6例，GOLD3 級69例，GOLD4 級15例；穩定期組分為GOLD2 級21例，GOLD3 級66例，GOLD4 級3例。急性加重期組男64例，女26例；年齡（74.87±8.09）歲；BMI（23.36±3.04）kg/m2。穩定期組男67例，女23例；年齡（75.40±8.16）歲；BMI（22.46±2.97）kg/m2。對照組男65例，女25例；年齡（74.06±7.82）歲；BMI（23.05±2.93）kg/m2。三組年齡、性別及BMI 比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得安徽醫科大學附屬巢湖醫院倫理委員會的批準，研究對象知情同意并簽署同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 急性加重期組 納入標準：①年齡＞50歲；②根據全球慢性阻塞性肺疾病倡議標準診斷為慢性阻塞性肺疾病；③至少連續2 d 出現至少2 種以下主要癥狀（呼吸困難增加、痰膿增加、痰量增加）或1 種主要和1 種次要癥狀（流涕/充血、喘息、喉嚨痛、咳嗽）的急性加重。排除標準：并發哮喘、肺癌或其他相關肺部疾病；嚴重感染、腫瘤、自身免疫性疾病的病史。

1.2.2 穩定期組 納入標準：①年齡＞50歲；②根據金標準診斷為慢性阻塞性肺病；③在過去的6個月無急性惡化。排除標準與急性加重期組相同。

1.2.3 對照組 排除患有感染、肺病、腎功能或肝功能障礙以及嚴重感染、惡性腫瘤、自身免疫性疾病史。

1.3 標本采集 慢阻肺急性加重期患者入院第1 天、穩定期慢阻肺患者和健康者體檢采集外周血。室溫靜置1 h 后，外周血在4 ℃下以3000 r/min 條件下離心15 min，獲得上清液，裝于的EP 管中，置于-80 ℃冰箱保存，集中進行檢測。

1.4 miR-146a/b 的檢測方法

1.4.1 miRNA 的提取 采用北京天根生化科技有限公司miRcute 血清/血漿miRNA 提取分離試劑盒DP503 提取研究對象的血清標本總miRNA，將獲得的miRNA 溶液置于-70 ℃冰箱保存備用。

1.4.2 RNA 逆轉錄合成cDNA 采用上海吉瑪制藥技術有限公司逆轉錄聚合酶鏈反應定量試劑盒逆轉錄為cDNA。

1.4.3 實時定量PCR 法 采用上海吉瑪制藥技術有限公司逆轉錄聚合酶鏈反應定量試劑盒，熒光定量PCR（Q-PCR）實驗染料法。miR-146a、miR-146b 以U6 為標準化內參。采用2-△△Ct 算法計算miR-146a、miR-146b 相對表達量。其中△△Ct=（Ct 實驗組目的基因-Ct 實驗組U6）-（Ct 對照組目的基因-Ct 對照組U6），qRT-PCR 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.5 血清炎癥標志物和肺功能指標的檢測方法

1.5.1 血清炎癥標志物（PCT、CRP 及ESR）表達水平的檢測方法 研究對象均在清晨空腹狀態下抽取靜脈血液5 ml，采用免疫散射速率比濁法測定超敏C反應蛋白（hs-CRP）表達水平；采用酶聯免疫吸附法測定PCT；采用魏氏法測定ESR 表達水平。

1.5.2 肺功能指標的檢測方法 所有研究對象均通過肺功能檢測儀檢測其肺功能包括1 秒用力呼氣量（FEV1）、1 秒用力呼氣量/用力肺活量（FEV1/FVC）和最大呼氣流量（PEF）。

1.6 統計學方法 采用統計學軟件SPSS 22.0 進行數據分析，計數資料使用（n）表示，比較采用χ2檢驗；計量資料的數據以（）表示，比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，miR-146a/b 相對表達量與GOLD 分期比較運用Kruskal-Wallis H 檢驗，與炎癥標志物和肺功能指標的相關關系使用Pearson 相關分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組肺功能指標比較 急性加重期組和穩定期組的FEV1、FEV1預測值、FEV1/FVC 均低于對照組，且穩定期組低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組肺功能指標比較（）

表2 三組肺功能指標比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與穩定期組比較，bP＜0.05

2.2 三組血清炎性標志物比較 急性加重期組血清PCT、CRP 及ESR 表達水平均高于穩定期組和對照組（P＜0.05）。穩定期組PCT、CRP 及ESR 表達水平均高于對照組（P＜0.05），見表3。

表3 三組血清炎性標志物比較（）

表3 三組血清炎性標志物比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與穩定期組比較，bP＜0.05

2.3 三組miR-146a/b 比較 急性加重期組血清中的miR-146a 水平低于穩定期組和對照組（P＜0.05）；穩定期組和對照組血清中miR-146a 水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；急性加重期組血清中的miR-146b 水平低于穩定期組和對照組（P＜0.05）；穩定期組和對照組血清中miR-146b 水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 三組miR-146a/b 比較（）

表4 三組miR-146a/b 比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05，cP＞0.05；與穩定期組比較，bP＜0.05

2.4 miR-146a/b 相對表達量與GOLD 分期的關系急性加重期組各GOLD 分期miR-146a/b 的表達量分布不全相同，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1A、圖1B；穩定期組中GOLD 分期miR-146a/b 的表達量分布不全相同，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1C、圖1D。

圖1 miR-146a/b 相對表達量與GOLD 分期的關系

2.5 miR-146a/b 的水平與血清炎性標志物和肺功能指標的相關性 急性加重期組和穩定期組血清中miR-146a/b 水平與PCT、CRP 及ESR 均呈負相關性關系，與FEV1、FEV1預測值、FEV1/FVC 均呈正相性關系，見表5、表6。

表5 急性加重期組miR-146a/b 表達量與各指標的相關性（r）

表6 穩定期組miR-146a/b 表達量與各指標的相關性（r）

3 討論

慢性阻塞性肺疾病是一個重大的全球性健康問題，與慢性氣道和肺實質炎癥有關[11]。20%的急性加重期慢性阻塞性肺疾病病例是由非感染因素引起的，而大多數慢性阻塞性肺疾病急性加重是由感染引起的。慢性阻塞性肺疾病患者的急性加重會增加氣道炎癥，增加炎癥因子的合成，激活補體系統，并導致體內炎癥增加，所以感染是導致慢性阻塞性肺疾病的最關鍵因素[10，12，13]。目前臨床上以患者有慢性咳嗽、咳痰、進行性加重的呼吸困難及有慢性阻塞性肺疾病危險因素的接觸史時，考慮慢性阻塞性肺疾病。肺功能檢查能明確診斷氣道的不可逆氣流受限；但并沒有新的、有效的生物標志物來診斷慢性阻塞性肺疾病。

MiR-146a 和miR-146b 屬于miR-146 家族[8]。MicroRNAs（miRNAs）是一個19～24個核苷酸的非編碼RNA 家族，其在轉錄后調節基因表達，具有重要的生物學功能[3，14]。慢性阻塞性肺疾病的加重可能會導致機體炎癥反應的加劇，從而導致血液循環中感染指標的變化。ESR、CRP、PCT 是提示感染的實驗室指標，可反映患者炎癥反應的水平[3，14]。

本研究結果顯示，急性加重期組血清炎性標志物和肺功能指標均高于穩定期組和對照組，說明急性加重期慢性阻塞性肺疾病比穩定期有更明顯的炎癥反應和肺功能下降。

近些年有研究表明[16-18]，miR-146a 下調白細胞介素1 受體（IL-1R）和Toll 樣受體（TLR）信號成分IL-1 受體相關激酶（IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關因子（TRAF6），對IL-1β、IL-6 和IL-8 等炎癥因子有著負反饋調節的能力。miR-146b-5p 在非小細胞肺癌（NSCLC）通過靶向IRAK1，抑制核因子κB（NF-κB）活性和NF-kB 相關IL-6、IL-8 的產生，且miR-146b-5p 與IRAK1 呈負相關；IRAK1 是IL-1R/TLR 信號通路中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與NF-κB 調節的炎癥反應、抗凋亡和腫瘤進展[19，20]，說明miR-146a/b 可能通過與靶mRNAs 的3UTR 相互作用來調節基因表達，導致翻譯抑制或mRNA降解，或者兩者兼有。另有研究證實，在未成熟樹突狀細胞（imdc）和成熟樹突狀細胞（mDCs）中過表達miR-146a 和/或miR-146b 則增加DC 凋亡，ImDC和MDCS 中miR-146a 和miR-146b 的表達與TRAF6 和IRAK1 的表達呈負相關。此外，TRAF6 和（或）IRAK1 的siRNA 沉默促進了DC 的凋亡。沉默miR-146a 和miR146b 可通過IL-12p70 介導的自然殺傷細胞活化增加IL-12p70、IL-6 和TNF-γ 的產生以及IFN-γ 的產生，而mDCs 中miR-146a 和miR-146b 的過表達則減少細胞因子的產生，在樹突狀細胞中miR-146a 和miR-146b 還可以下調NF-κB[3]。因此推測出一種負反饋機制，即miR-146a/b-TRAF6/IRAK1-NF-kB 軸調節人樹突狀細胞凋亡和細胞炎癥因子的產生，進而調節炎癥反應，說明miR-146a/b 是一種抗炎miRNA。本研究結果顯示，在急性加重期組和穩定期組中miR-146a/b的相對表達量與血清炎性標志物呈負相關，與肺功能呈正相關；并且急性加重期組的miR-146a/b 的相對表達量低于穩定期組，進而推測出miR-146a/b在炎癥激活的調節中都起著關鍵作用，在慢性阻塞性肺疾病中miR-146a/b 低表達減少對炎癥反應的抑制，抗炎作用減弱，導致炎癥因子的大量分泌，增加了炎癥反應，進而破壞肺泡細胞使肺功能進一步下降，使病情更加惡化。因此，miR-146a/b 的相對表達量可能診斷出急性加重期慢性阻塞性肺疾病，而穩定期組與對照組的miR-146a/b 的相對表達量相似，所以不能通過miR-146a/b 來診斷穩定期的慢性阻塞性肺疾病。

綜上所述，miR-146a/b 在急性加重期慢性阻塞性肺疾病患者的血清中低表達，與炎癥反應水平呈負相關，與肺功能指標呈正相關，miR-146a/b 有望成為輔助急性加重期慢性阻塞性肺疾病早期診斷的重要生物分子標志物，對急性加重期慢性阻塞性肺疾病的早期診斷和預后具有重要價值。本研究尚存不足之處，包括樣本量不足及尚未研究miR-146a/b 在肺組織中的表達情況等，仍需要深入研究。