牡丹遠緣雜交障礙克服措施探析

王二強，王曉暉，冀含樂，韓鯤，盧林，王占營

（洛陽農林科學院，河南 洛陽 471023）

牡丹為芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia）植物，在我國栽培歷史悠久，分布廣泛，深受我國各族及世界人民的喜愛，自古被尊為“花中之王”[1]。牡丹所有野生原始種均分布于我國，由革質花盤亞組（Subsection Vaginatae）和肉質花盤亞組（Subsection Delavayanae）兩種類型9 個種構成，即卵葉牡丹、矮牡丹、楊山牡丹、紫斑牡丹、四川牡丹、大花黃牡丹、黃牡丹、紫牡丹和狹葉牡丹[2]。近年來，隨著牡丹科研及應用領域的進一步推進，牡丹栽培用途已經由傳統的藥用、觀賞發展到綜合利用開發階段。新、奇、特及專用型品種的培育一直是牡丹科研和生產的主要內容，目前國內栽培品種多是在品種群內或品種群間近緣雜交選育的結果，新品種培育在亞組內雜交已經難以有所突破，加大牡丹亞組間以及牡丹與芍藥組間的種質基因交流培育遠緣雜交品種將成為實現中國牡丹新品種重大突破的首要途徑。相反國外培育的牡丹品種多通過亞組間和組間雜交而來，目前亞組間品種已超過1 000 個，主要分布于美國、歐洲和澳大利亞；組間雜種注冊量已超150 個品種[3]。中國在牡丹遠緣雜交育種方面雖有一定成效，但與歐美一些國家相比雜交工作的開展明顯滯后，進展緩慢，牡丹遠緣雜交品種在世界范圍內的接受、推廣程度差距甚遠，富含優良性狀的珍稀牡丹資源的挖掘、保護、研究和利用程度有限，尤其遠緣雜交過程中出現的雜交不親和及胚敗育現象無法得到有效克服，導致牡丹遠緣雜交新品種培育效率低下、突破有限。本文總結了近些年來牡丹組間及亞組間遠緣雜交的一些經驗，并分析了遠緣雜交過程中花粉受精前后障礙及克服措施，以期為今后牡丹育種工作者提供參考，進而加速牡丹育種進程。

1 牡丹遠緣雜交育種現狀

1.1 牡丹亞組間遠緣雜交

牡丹亞組間遠緣雜交最早在法國開展，肉質花盤亞組紫牡丹和黃牡丹野生種在歐美牡丹雜交育種中起了重要作用。黃牡丹在法國引種成功后，Henry[4]用中國栽培品種與它雜交，培育出世界上第一個黃色雜種牡丹‘Mm.Louis Henry’，同時期，Lemoine[4]在法國南錫也用滇牡丹（紫牡丹、黃牡丹、狹葉牡丹的統稱）和中國牡丹栽培品種間開展類似雜交，并在1900年前后培育出11 個亞組間雜種品種，后被稱為Lemoine 系（P.lemoinei）。Lemoine 系牡丹亞組間雜種具有黃牡丹純正的黃色，同時又具有中國傳統品種重瓣、垂頭和藏花等性狀。20世紀初，美國Saunders[4]用從英國引入的肉質花盤亞組滇牡丹與結實性較強的日本牡丹（P.suffruticosa Japan Group）單瓣、半重瓣類型雜交，所得F1 代雜種花色豐富，花型為單瓣或半重瓣，花頭直立并高出葉面，克服了Lemoine 系牡丹亞組間雜種的不足。其中最為著名并在世界范圍內得到廣泛推廣的有含滇牡丹基因‘中國龍’、‘黑海盜’、‘金色年華’和‘海黃’等[5]。后來美國育種家Daphnis[4]也開展了大量類似工作，以Saunders 培育品種為基礎通過回交手段培育出亞組間新品種50 多個，這類品種的觀賞品質也得到顯著提高。歐美品種群牡丹品種類型多為亞組間雜種，此類品種特異性突出、觀賞性強。

20世紀90年代末，伴隨歐美品種的引進，中國肉質花盤亞組野生種資源挖掘、保護工作得到高度重視，中國牡丹育種工作者，開始著手利用野生種質資源開展亞組間遠緣雜交工作。目前甘肅省林業科技推廣總站、中國芍藥科植物野生種遷地保護課題組、洛陽農林科學院和陳德忠等[6-9]科研單位或個人在牡丹亞組間新品種培育方面已取得突破，陸續公布不少牡丹亞組間雜交新品種，但是育種過程中雜交不親和及胚敗育現象普遍存在。

當前世界范圍內流行的亞組間牡丹品種多為紫牡丹和黃牡丹參與雜交形成的品種類型，盡管后來大花黃牡丹也曾用于同普通栽培品種的雜交，但此類亞組間雜種未見流行；狹葉牡丹更是未見有雜交育種成功的報道。可見大花黃牡丹、狹葉牡丹同革質花盤亞組牡丹雜交過程中，雜交障礙問題更為嚴重，其育種潛力有待進一步挖掘。

1.2 芍藥屬組間遠緣雜交

芍藥科芍藥屬只有牡丹組、芍藥組及北美芍藥組3 類植物，但它們在生長習性方面差別顯著，芍藥組植物為草本類型，而牡丹組植物為木本灌木，因此在牡丹組和芍藥組植物間雜交取得成功曾被認為是不可實現的夢[10]。因此牡丹組與芍藥組組間雜交的成功是芍藥屬植物一個非常富有創新性的突破成就，在整個牡丹育種界引起轟動，這種類型的開展由日本育種家伊藤（Toichi Itoh）率先締造，后來在美國廣為發展。以紀念日本這位首開牡丹組間雜交先河的育種家，將其及后來由芍藥和牡丹雜交形成的組間雜種命名為Itoh雜種。

Itoh 雜種將牡丹和芍藥的性狀進行了充分結合，根系與牡丹高度相似，但冬季地上莖稈大部分干枯，僅在植株莖基部保留少量木質化并形成花芽，更似芍藥草本植物性狀。葉裂似牡丹，但質地更接近芍藥。Itoh雜種整體植株優美，莖干挺拔，花色豐富，枝葉繁茂，雜種優勢突出，抗性強[11,12]。花期恰好介于牡丹和芍藥之間，極具觀賞和推廣價值。

芍藥屬組間雜交類型分為3 種，即‘芍藥牡丹’；‘牡丹芍藥’；‘牡丹、芍藥北美芍藥’或其反交。目前市場上廣為流行的Itoh 雜種都為‘芍藥牡丹’（正交）的后代，并且個別材料之間雜交親和性較高，如以‘Martha Washington’‘Golden Era’、‘Martha Washington’‘Smith’s Yellow’、‘Kakoden’‘Alice Harding’等組合培育的Itoh 雜種數量占40%以上[13,14]。而‘牡丹芍藥’、‘牡丹北美芍藥’或其反交雜交類型，僅有獲取雜交種或極少量發芽種苗的報道，但未有雜交種登錄。

中國芍藥屬組間育種工作起步較晚。2008年證實中科院植物研究所劉政安博士發現的‘和諧’為我國首例牡丹、芍藥組間雜種[15]。后來北京林業大學成仿云教授牡丹課題組、洛陽國家牡丹園牡丹育種團隊等在Itoh雜種品種培育方面均有突破，先后培育出‘京華高靜’、‘京華朝霞’、‘京桂美’、‘京俊美’、‘河洛錦繡’和‘洛神奇花’等品種。但在組合設置及親本材料選擇方面仍缺乏創新，品種的培育仍局限于特定組合或親本材料，創新性組間雜交材料的挖掘及雜交障礙問題破解依然沒得到有效解決。

2 牡丹遠緣雜交常見障礙機理分析

2.1 遠緣雜交不親和表現

2.1.1 花粉萌發障礙 花粉和柱頭相互作用識別過程發生障礙是雜交不親和的首要原因，當遺傳距離比較遠的花粉落在花朵柱頭上后，因花粉與柱頭形態學上不匹配以及花柱細胞和柱頭的物理、化學性質，柱頭乳突細胞產生胼胝質，導致花粉不具備萌發條件而被雌蕊拒絕[16]。另外雜交如果不在母本柱頭可授期內進行，因缺乏母本柱頭黏液刺激，也可能導致父本花粉不能萌發。

2.1.2 花粉管生長障礙 雜交不親和的植物屬種授粉后個別組合類型花粉能夠正常萌發，但柱頭、花柱細胞往往產生較多胼胝質而抑制花粉管的正常生長，主要表現在萌發的花粉管在柱頭或花柱內發生扭曲、纏繞和分叉等異常現象，最終導致花粉管無法到達胚珠完成受精作用[17]。研究表明，黃牡丹與芍藥栽培品種雜交及芍藥‘粉玉奴’與牡丹‘鳳丹白’雜交試驗中，授粉后，父本花粉可在柱頭上萌發，由于柱頭胼胝質的產生，導致大部分花粉管生長緩慢且異常，僅有少數花粉管進入柱頭，但不能有效進入子房完成受精[18,19]。可見花粉管生長異常、受阻在牡丹遠緣雜交過程中比較常見，是母本柱頭和花粉識別不暢通的重要表現。

2.1.3 精卵融合障礙 遠緣雜交過程中，部分花粉能夠正常萌發，并且花粉管能夠達到胚珠釋放精子，但是釋放的精細胞不能和卵細胞或中央極核完成融合形成正常合子，造成假受精或不受精，從而造成在種子發育過程中無正常胚或胚乳的現象。

2.2 牡丹遠緣雜交雜種不育性的表現

2.2.1 幼胚不能正常發育 芍藥屬植物胚根據發育進程分為原胚階段、器官分化階段與生長成熟階段，原胚階段根據發育程度逐漸經歷游離核、細胞化以及胚原基發生和球形原胚等時期。核型胚乳的發育進程同樣需要經歷游離核、細胞化及生長成熟3 個連續的發育階段。遠緣雜交過程中往往由于親本材料遺傳差異較大，常常引起受精或幼胚細胞分裂異常現象造成胚或胚乳不能正常發育[20]。胚及胚乳發育過程中任何環節出現問題以及胚、胚乳及母體組織出現發育不協調等現象，都將造成種胚敗育或幼胚早夭現象。在‘鳳丹白’‘川赤芍’雜交實驗中，研究發現雜種胚發育過程主要停留在游離核至細胞化階段，同時胚乳游離核分裂能力很差，大部分胚乳游離核數目達到10～20 個即停止分裂并逐漸解體，導致正常胚乳的形成極其緩慢，造成雜種原胚因缺乏營養物質而不能正常發育，從而導致雜種胚早期解體[21]。

2.2.2 雜種不能萌發或發芽后死亡 遠緣雜交雜種幼胚、胚乳和母本子房組織之間經常出現發育不協調問題，特別是胚乳發育不正常，導致幼胚發育缺乏營養，使雜種胚部分或全部壞死[22-24]，另外有些雜種在沒有充分成熟而母本果莢提前開裂，這種情況下有些雜交類型雖能得到含雜種胚的種子，但種子往往不能發芽，或者即便發芽，在苗期也會多數死亡。試驗中發現，牡丹遠緣雜交部分組合能夠收到不少外觀正常的種子，但是播種后發芽率低或萌芽后死亡現象嚴重，其主要原因是種子在發育過程中，胚珠外珠被和內珠被正常發育為外種皮和內種皮，而胚乳、胚的發育早期停止導致種子為空心種子，少數相對飽滿的種子由于胚后期分化不完全而不能萌發，個別種子萌發后由于胚乳營養供應不夠而早期死亡，只有極少數胚乳、胚發育正常且協調的種子能夠正常萌發成為雜種苗。

2.2.3 遠緣雜種F1 代植株高度不育 牡丹組間及亞組間雜種植株具備形態正常的雌雄蕊結構，但均表現高度不育，極大地限制了其性狀的進一步改良[25,26]。植物細胞減數分裂過程中的染色體行為是影響配子形成和育性的關鍵[27]。染色體的異常行為在牡丹亞組間雜種減數分裂過程中十分普遍，較野生種和亞組內雜種牡丹更復雜，是造成亞組間雜種不能產生正常配子的重要原因。通過對亞組間遠緣雜種‘海黃’細胞減數分裂的觀察，發現在減I中期單價體和多價體普遍存在，造成大多數細胞中的同源染色體不能準確地分配到兩極，另外減I 和減II 中有大量染色體橋和斷片的存在，使細胞減數分裂過程不能正常完成而形成可育配子。另外研究中發現同為亞組間雜種的‘夢幻’則為混倍體，其細胞減數分裂中的染色體行為更為混亂、異常，植株呈現完全不育狀態[28]。而通過對牡丹芍藥組間雜種進行核型分析，研究發現Itoh 雜種為三倍體（2n =3x=15），屬2A 型核型[29]。因為三倍體植物在減數分裂聯會時通常會形成三價體、單價體甚至是多價體等二價體以外的構型，造成染色體行為異常，從而高度不育[30]。總之，染色體行為異常是造成牡丹遠緣雜種高度不育的本質原因。

3 牡丹遠緣雜交障礙克服措施

3.1 授精前障礙克服措施

3.1.1 花粉活性保證與母本可授期把握 花期不遇是牡丹遠緣雜交過程的常見問題，通過花粉貯藏能夠有效解決雜交親本材料之間花期不育問題[31]，確保貯藏花粉具有較高活力是開展雜交工作的前提。溫度和花粉含水量是影響花粉儲藏時間和活力的重要因素，一般在超低溫環境下，干燥的牡丹花粉壽命可保持2年以上[32,33]。但在 18 ℃和 20 ℃環境貯藏是解決牡丹雜交育種花期不遇最經濟有效的方法[34]。在授粉時要對貯藏的花粉進行必要的活力測定試驗，同時對母本植株進行可授性試驗，確保擁有較高活力的花粉在牡丹柱頭黏液分泌期內實施授粉是解決雜交不親和的首要環節。

3.1.2 創造花粉在母本柱頭萌發環境 花粉萌發及生長條件的營造也能有效促進雜交親和性。通常通過對母本柱頭涂抹激素或其他化學溶液，模擬成熟柱頭黏液分泌過程，創造花粉萌發、生長環境，減少花粉萌發環節障礙，提高父母本之間雜交親和性。試驗表明，授粉前用KCl（3.5%）和赤霉素（GA3:25 mg/L）或合適濃度的硼酸、蔗糖溶液處理柱頭有利于提高牡丹雜交結實率[35,36]。

3.1.3 積極探索適宜授粉方式 蒙導授粉、重復授粉、蕾期授粉和延遲授粉等授粉方式常被用作克服遠緣雜交不親和的有效手段[37,38]。在牡丹遠緣雜交過程中，要針對組合配置情況，探索最佳授粉方式，有效提高雜交親和性。在‘粉玉奴鳳丹白’、‘粉玉奴洛陽紅’雜交實驗中，采用重復授粉、蒙導授粉和延遲授粉的效果均優于常規授粉，在花粉萌發量、花粉管伸長及單花結實率方面延遲授粉對于克服受精前障礙效果最佳，為最佳授粉方式[39]。但不同品種個體間差異顯著，因此在牡丹遠緣雜交育種中，針對組合設置類型，探索最適宜授粉方式，能夠減弱甚至克服母本柱頭或花柱對異源花粉萌發及花粉管生長的抑制，提高育種效率。

3.1.4 嘗試柱頭切割、移植及花粉注射措施 在遠緣雜交過程中，親緣關系較遠的種屬雜交時，常常由于花粉及柱頭識別不暢通造成柱頭或花柱大量胼胝質產生導致雜交不親和，切割柱頭法能夠有效回避花粉柱頭識別環節障礙，研究表明，切割柱頭授粉法在細葉百合和亞洲百合的雜交實驗中，能夠顯著提高雜交親和性，提高雜交結實率[40,41]。在牡丹與芍藥遠緣雜交過程中切割柱頭授粉后，花粉萌發量雖然較少，但能有效降低胼胝質的產生，有少量花粉管能夠穿過柱頭伸進子房，表明切割柱頭授粉法對于克服受精前障礙有一定的效果[39]。另外柱頭移植[42]及花粉和萌發劑混合液子房注入法也要及時進行嘗試探索，評價其具體應用效果。

3.2 牡丹遠緣雜交不育障礙克服措施

3.2.1 幼胚拯救 遠緣雜交過程中，部分雜交類型能夠克服受精前各種障礙完成授精作用，精卵細胞正常融合形成合子后，合子即開始有絲分裂發育形成胚，初生胚乳核發育形成胚乳，同時胚、胚乳及母本子房組織發育協調，最終形成功能正常的可萌發種子[43]。但遠緣雜交雜種在發育過程中，往往由于雜種幼胚、胚乳組織或母體組織之間發育不協調等因素常引起胚降解、敗育或雜種不育現象，這種雜種不能正常發育所引起的雜種崩潰現象均為受精后障礙，受精后障礙是導致遠緣雜交失敗的關鍵因素。

能夠通過胚拯救措施對幼胚發育早期敗育或雜種胚無法播種成苗等問題進行有效克服。幼胚拯救用于解決遠緣雜交育種受精后障礙問題已經在蔬菜、花卉和果樹等領域得到廣泛應用[44-46]。通常情況下，根據培養對象不同，胚拯救主要通過幼胚培養、胚珠培養和子房培養實現，另外幼胚發育不同階段進行離體培養拯救的措施和成功率差別很大[47]。牡丹遠緣雜交胚拯救難易程度同樣與胚齡關系密切，處于發育階段初期的幼胚對環境和營養條件要求很嚴格，幼胚自身完全處于異養狀態，培養成功率很低。但培養措施太晚，幼胚可能已經發生降解，同樣不易培養成功，因此幼胚降解臨界點是進行胚拯救的最佳時期[45]。律春燕[14]采用子房培養的方式將亞組間雜交類型母本子房置于含有0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA 的MS 培養基上培養，受精后障礙得到有效地克服，并且篩選出適宜的生根培養基。賀丹等[48]通過對芍藥‘粉玉奴’與牡丹‘鳳丹’的雜種胚珠進行培養進一步發現胚齡及對應培養基類型是影響胚拯救成功率的重要因素。可見，胚拯救的成敗不僅與胚齡密切相關，同樣與對應時期的培養基激素組合密切相關。目前在牡丹雜交育種工作中，胚培養技術體系尚不成熟完善，幼胚繼代培養褐化現象的解決及合理培養基、激素的搭配選擇等還需進一步研究，一套成熟的牡丹胚拯救技術體系還需進一步深入研究。

3.2.2 染色體加倍恢復遠緣雜種育性 通過雜交措施獲得的遠緣二倍體雜種，由于雜交過程中親本遺傳差異顯著，在細胞減數分裂時染色體異常行為普遍，無法產生正常配子，導致雜種不育[49]。對于這種情況，可嘗試通過秋水仙素處理雜種幼苗或成年植株芽體，使細胞染色體數加倍成為異源四倍體（即雙二倍體），解決細胞減數分裂中同源染色體無法配對聯會現象，從而產生正常配子，恢復自身育性[50-52]。今后通過染色體加倍措施使牡丹亞組間雜種或組間雜種育性得到有效恢復，并進一步挖掘利用其育種價值將是牡丹新品種培育取得進展的重要突破手段。

4 展望

中國在芍藥屬植物遠緣雜交育種方面起步較晚，取得的成就較歐美、日本等國差距甚遠，目前遠緣雜交機制研究方面還比較膚淺，研究方法和技術手段比較單一，許多野生種和優良品種資源沒有得到充分利用，在遠緣雜交不親和障礙機制及雜種不育方面研究缺乏具有可操作性的突破成就。近緣雜交在牡丹品種創新方面已很難突破，在未來育種工作中要堅持不懈地開展組間、亞組間遠緣雜交，同時要積極開展雜交機理研究，積累技術經驗，突破雜交不親和及雜種不育難題，建議加強做好如下工作：

4.1 加強種質資源保護，探索親和性好的組間及亞組間親本材料

中國是公認的芍藥屬植物資源分布和栽培中心，尤其牡丹組野生種均原產中國，其中紫牡丹、黃牡丹引到國外被廣泛用于雜交育種，培育出大批亞組間牡丹新品種。另外國際上Itoh 雜種的培育還僅僅局限于個別材料或組合類型，因此今后要重視國內種質資源的收集、保護工作，尤其針對珍稀野生資源要盡快建立遷地保護圃，同時收集國外組間及亞組間品種類型，在此基礎上加強各類資源的研究和綜合利用，借鑒國內外遠緣雜交成功經驗，探索新的組間、亞組間雜交創新資源材料。

4.2 探索恢復亞組間雜種及Itoh雜種的育性

通常情況下牡丹亞組間雜種和Itoh 雜種由于染色體異常問題而表現高度不育，但是也存在獲得正常種子的微小概率，我們在育種工作中要用心去把握牡丹遠緣雜種結實的微小幾率獲得F2 代植株，并充分挖掘利用F2 代植株育種價值[53]。另外要積極探索染色體加倍育種技術的利用，通過秋水仙素處理措施使遠緣雜種植株染色體加倍，從而克服雜種不育問題，充分挖掘亞組間雜種及Itoh 雜種三倍體的育種潛能。

4.3 結合細胞遺傳學與生物信息學，深入開展雜交障礙機制及克服措施研究

隨著細胞遺傳學與生物信息學的快速發展，在今后牡丹育種研究工作中綜合生物信息學和基因組學等技術手段從分子學、生殖生物學等方面去解析牡丹遠緣雜交不親和及雜種不育機理，積極探索雜種幼胚拯救技術，找到一套行之有效的遠緣雜交障礙克服措施，為牡丹遠緣雜交的順利開展保駕護航。