HPLC法測定血平片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量研究

劉厚權，林飛英，肖忠訓，何虎冰，胡吉忠，夏淑英，周朝忠，肖紹川，康興東

（江西普正制藥股份有限公司，江西 吉安 343100）

血平片由地黃、熟大黃、地榆、三七、海螵蛸、茜草和炒蒲黃等7 味藥材組成，具有清熱化瘀、止血調經的功效，臨床用于治療因血熱挾瘀所致的崩漏[1]。血平片處方中7 味藥材均具有止血的功效，現行質量標準中僅采用HPLC 測定大黃素和大黃酚的含量，顯然不利于保障血平片產品品質，尤其是三七作為血平片處方中唯一的貴重藥材，理應建立其含量測定方法。羅漢宇等[2]建立了三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1總含量的HPLC 檢測方法，但其供試品溶液制備方法比較繁瑣，不利于檢驗操作。《中國藥典》2020年版一部[3]中三七藥材是采用HPLC 測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1三者的總含量；珍黃膠囊[4]、腦脈泰膠囊[5]、活血止痛膠囊[6]、滇女金丸[7]和虎力散片[8]等含有三七的中成藥制劑也均采用HPLC法測定其中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量，可以較好地保障產品品質。故本研究選擇三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1為指標成分，采用HPLC 法建立了對血平片中三七的含量測定方法。該方法簡便易行，可以有效控制該制劑的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設備

Waters 2695 型高效液相色譜儀（含自動進樣器、PDA 檢測器）；AUW220D 十萬分之一電子分析天平（日本島津公司）；AB104-N 萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；

HH-2數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；Mili-Q 超純水儀（美國Milipore 公司）；SHB-IV 循環水式真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）。

1.2 試劑與試藥

三七皂苷R1對照品（批號：110745-201318，質量分數94.0%）、人參皂苷Rg1對照品（110703-201128，質量分數93.4%）、人參皂苷Rb1對照品（110704-201223，質量分數95.9%）均由中國藥品生物制品檢定研究院提供；乙腈（色譜純）、甲醇（分析純）、正丁醇（分析純）、氨試液（分析純）、乙醇（分析純）、水均來自自制超純水。血平片共10 批（江西普正制藥有限公司，批號分別為：171101、171102、171201、171202、180101、180401、180402、180901、180902、181001，規格：每片重0.3 g）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為安捷倫C1（8250 mm 4.6 mm，5m）色譜柱，以乙腈為流動相A，水為流動性B，梯度洗脫（0～20 min，A：20%；20～75 min，A：20%～32%）；流速為1.0mL/min；檢測波長200nm，柱溫30℃；進樣量10L。

2.2 不含三七的陰性樣品溶液的制備

取大黃150 g，粉碎成粗粉，與450 g地黃混合，加80%乙醇6 倍量，加熱回流提取2 次，每次1 h，合并乙醇提取液，濾過，濾液備用。藥渣與其他中藥地榆、海螵蛸、茜草和蒲黃（炒）加水煎煮3 次，每次1h，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為的1.10～1.15（60 ℃）清膏，加入乙醇使含醇量達50%，攪勻，冷藏，取上清液與上述醇提液合并，減壓回收乙醇，并濃縮成相對密度為1.25～1.30（60 ℃）清膏，80 ℃干燥，粉碎成細粉，加入淀粉55 g，混勻，制粒，干燥，加入硬脂酸鎂2 g，混勻，即得。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取三七皂苷R1對照品4.15 mg，人參皂苷Rb1對照品4.77 mg、人參皂苷Rg1對照品4.27 mg，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。

2.4 血平片樣品溶液制備方法

取本品20 片，除去薄膜衣，研細，精密稱定1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇50 mL，稱重，回流提取2 h，取出，放冷，用水飽和的正丁醇補足減失的重量，濾過，精密量取續濾液25mL，置分液漏斗中，用氨試液25 mL 洗滌1 次，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解并稀釋至25mL，搖勻，濾過，即得。

2.5 系統適應性試驗

取血平片樣品、陰性樣品，分別按“2.4”項下制備方法制得供試品溶液及陰性對照溶液，精密量取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10L 注入液相色譜儀，結果見圖1；結果顯示，在供試品溶液色譜圖中，與三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1色譜峰相應的位置上有色譜峰，且陰性樣品無干擾。

圖1 混合標準品（A）、供試品（B）和陰性對照品（C）色譜圖Fig.1 The chromatograms of the mix standard (A)、spmples (B) and the negative control (C)

2.6 線性關系考察

取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rg1對照品，分別制成不同濃度，取10L注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明，三七皂苷R1 在10.38～332.12g/mL范圍內，峰面積與對照品濃度呈良好的線性關系，其線性回歸方程y=2 904 700x 7 487.06，R2=0.999 9；人參皂苷Rg1 在11.93～381.89g/mL 范圍內，峰面積與對照品濃度呈良好的線性關系，其線性回歸方程y=3 190 827x 5 294.24，R2=0.999 8，人參皂苷Rg1在10.69～342.20g/mL 范圍內，峰面積與對照品濃度呈良好的線性關系，其線性回歸方程y=2 946 742x-913.07，R2=0.999 9。

2.7 精密度試驗

取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg1混合對照品溶液連續進樣6 次，每次吸取10L 注入液相色譜儀，記錄峰面積。求得三七皂苷R1 峰面積的RSD值為3.27%，人參皂苷Rg1峰面積的RSD值為2.64%，人參皂苷Rb1峰面積的RSD 值為4.03%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批血平片樣品1.0 g（181001 批，6份），按供試品溶液制備方法制備，每次吸取10L，注入HPLC 儀器中進行測定，計算含量。結果表明，本品中三七皂苷R1含量平均值為0.23 mg/片，RSD 值為5.04%；人參皂苷Rg1含量平均值為0.75 mg/片，RSD值為1.36%；人參皂苷Rb1含量平均值為1.85 mg/片，RSD 值為0.93%。

2.9 穩定性試驗

精密吸取同一份血平片供試品溶液，于0 h、2 h、4 h、12 h、18 h 和24 h 進樣，測定峰面積，得到三七皂苷R1峰面積的RSD 值為3.24%，人參皂苷Rg1峰面積的RSD 值為2.62%，人參皂苷Rb1峰面積的RSD值為4.00%，表明血平片供試品溶液在24 h 內穩定。

2.10 加樣回收率試驗

精密稱取血平片樣品（6 份），分別加入三七皂苷R1對照品1.22 mg、人參皂苷Rg1對照品10.29 mg、人參皂苷Rb1對照品3.53 mg，按“2.4”項下制備方法制得供試品溶液，每次吸取10L，注入HPLC 儀器中進行測定，其結果見表1。結果顯示，三七皂苷R1的平均回收率為97.7%，RSD 值為3.18%；人參皂苷Rg1的平均回收率為98.6%，RSD 值為0.55%；人參皂苷Rg1的平均回收率為100.4%，RSD 值為1.82%。表明該測定方法偏差較小，回收率良好。

表1 加樣回收率實驗結果Table 1 The result of the recovery test

2.11 樣品含量測定

取10 批血平片成品按“2.4”項下制備方法制得供試品溶液，每次吸取10L，注入HPLC 儀器中進行測定。結果見表2；結果顯示，10 批血平片的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rg1總含量范圍在1.18～2.15mg/片。

表2 10 批血平片含量測定實驗結果Table 2 The content determination result of 10 batches of Xueping Tablets

3 討論

目前關于血平片的研究報道較少，其中在檢測方法方面僅有羅漢宇等研究建立的方法，但該方法中供試品溶液制備方法比較繁瑣，不利于實際生產時的產品檢測操作。由于三七既是貴重藥材，又具有良好的止血效果，是血平片處方中非常重要的藥材。因此，有必要對血平片中的三七實施質量控制。

本試驗參考三七藥材及多種含三七的中成藥制劑的檢測方法，選擇三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg1為檢測指標成分，采用水飽和正丁醇提取、弱堿試液洗滌供試品的處理方法，建立了相對簡便的HPLC 含量測定方法，該方法可以有效控制血平片制劑的質量。