尿路分離利奈唑胺不敏感糞腸球菌耐藥機制及毒力基因研究

牛冬梅，宋佳希，周萬青，劉興全

0 引 言

近年來，作為腸道正常菌群的腸球菌屬已成為院內(nèi)感染重要病原菌，可造成患者尿路感染、血流感染等[1]。其中糞腸球菌和屎腸球菌所造成的感染比例占腸球菌屬90%[2]。流調(diào)數(shù)據(jù)顯示，腸球菌在尿路中的分離率占第一位[3]。由腸球菌造成的感染難治性與菌株天然耐藥或獲得性耐藥，特別是萬古霉素耐藥、利奈唑胺耐藥腸球菌的不斷檢出[3-4]，給臨床抗感染診療帶來挑戰(zhàn)。利奈唑胺(linezolid，LZD)作為噁唑烷酮類抗生素，2001年上市并用于萬古霉素耐藥腸球菌(vancomycin resistant enterococci，VRE)等多種革蘭陽性菌的感染治療。然而，近年來，利奈唑胺耐藥糞腸球菌的臨床檢出呈逐年上升趨勢[4]。研究發(fā)現(xiàn)，腸球菌所攜帶的多種毒力基因(esp、gelE、asa1、cylA等)決定了菌株的致病性，同時對于生物膜形成也至關(guān)重要[5]。更為嚴(yán)重的是，攜帶多種毒力基因且對多種抗菌藥物耐藥菌株的出現(xiàn)[6]，增加臨床治療的難度。為了探明臨床尿路感染中分離利奈唑胺不敏感糞腸球菌具體耐藥機制及毒力基因的攜帶情況，本研究對臨床尿路感染分離糞腸球菌攜帶毒力基因情況及與利奈唑胺耐藥間的關(guān)系進行探討，為臨床治療提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源收集南京鼓樓醫(yī)院2014-2019年臨床中段尿樣本中分離培養(yǎng)獲得非重復(fù)糞腸球菌株72株，使用Vitek 2 Compact 全自動微生物分析儀鑒定到菌種。依據(jù)菌株對利奈唑胺最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)分為利奈唑胺不敏感菌株(MIC≥4 μg/mL)和敏感菌株(MIC≤2 μg/mL)，分別為23株和49株。糞腸球菌ATCC 29212質(zhì)控菌株、cfr基因陽性對照頭狀葡萄球菌SA10106及optrA陽性菌株為南京鼓樓醫(yī)院微生物室保存菌株[4]。

1.2 主要儀器和試劑Vitek 2 Compact全自動鑒定藥敏分析系統(tǒng)及配套GP鑒定卡、GP67藥敏卡(法國梅里埃公司)；利奈唑胺E-test(安圖公司)；2×Taq Mix(DBI公司)；PCR擴增儀(ABI公司)；蛋白酶K(Merck公司)；瓊脂糖干粉(法國Biowest公司)；100 bp DNA Marker(大連Takara公司)；Gelrad染色液(美國BIOTIUM公司)；電泳儀及GelDoc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rod公司)；PCR引物合成及擴增產(chǎn)物測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 藥敏試驗采用Vitek 2 Compact全自動鑒定藥敏分析系統(tǒng)及配套GP67藥敏卡進行藥物敏感性檢測；對檢出利奈唑胺不敏感菌株采用E-test進行復(fù)核，結(jié)果判讀依據(jù)CLSI 2019標(biāo)準(zhǔn)[7]進行。

1.4 耐藥基因擴增及測序采用加熱煮沸法提取細(xì)菌DNA[8]，挑取純培養(yǎng)菌落于內(nèi)含200 ng/mL蛋白酶K溶液的1.5 mL離心管內(nèi)，56 ℃水浴2 h，后置95 ℃水浴10 min，13 000×g離心30 s，上清液即為基因檢測模板。參照文獻[8]合成介導(dǎo)利奈唑胺耐藥決定基因cfr、optrA和23S rRNA V區(qū)擴增引物并進行PCR擴增分析。引物序列見表1。采用25 μL體系：2×Taq Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 °C 5 min；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 30 s，共30個循環(huán)；72 °C 7 min。陽性擴增產(chǎn)物由上海生工生物公司進行Sanger測序分析，并經(jīng)BLAST比對分析。

1.5 毒力基因PCR擴增參照文獻[9-10]合成腸球菌毒力基因cylA、esp、asal、hyl、gelE和agg擴增引物并進行PCR擴增檢測。引物序列見表1。其中cylA、esp、asa1、hyl和gelE基因為50 μL多重檢測體系：2×Taq Mix 25 μL，DNA模板2 μL，cylA、esp、asa1、hyl和gelE的上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 13 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。agg為25 μL反應(yīng)體系：2×Taq Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Gelrad染色后觀察結(jié)果。

表1 耐藥基因擴增及測序所用引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析，率的比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏結(jié)果23株利奈唑胺不敏感糞腸球菌對利奈唑胺的MIC分布為4～256 μg/mL，其中MIC 4 μg/mL為2株，MIC 6 μg/mL為2株，MIC 8 μg/mL為1株，MIC 12 μg/mL為5株，MIC 16 μg/mL為3株，MIC 24 μg/mL為3株，MIC 32 μg/mL為4株，MIC 48 μg/mL為1株，MIC 256 μg/mL為2株。所有菌株對萬古霉素均敏感。

2.2 耐藥基因結(jié)果23株利奈唑胺不敏感糞腸球菌中13株檢出optrA基因，其余10株未檢出該基因；所有菌株未檢出cfr基因及檢出23S rRNA V區(qū)突變。

2.3 毒力基因結(jié)果72株糞腸球菌檢出asa1(81.9%，59/72)、esp(75%，54/72)、cylA(72.2%，52/72)、gelE(62.5%，45/72)和agg(19.4%，14/72)基因，未檢出hyl基因。23株LZD不敏感菌株以asa1(73.9%，17/23)基因檢出率最高，其次為esp、cylA、gelE和agg；49株LZD敏感菌株中asa1(85.7%，42/49)基因檢出率最高，其次為cylA、esp、gelE和agg。LZD敏感菌株中cylA和gelE基因檢出率高于LZD不敏感菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 尿路分離糞腸球菌毒力基因攜帶情況[陽性株數(shù)(%)]

3 討 論

革蘭陽性球菌耐利奈唑胺主要由23S rRNA等位基因V區(qū)核苷酸突變，核糖體L3和(或)L4的突變，以及菌株攜帶氯霉素-氟甲砜霉素耐藥基因(chloramphenicol-florfenicol resistance，cfr)[8, 11-12]，從而導(dǎo)致利奈唑胺藥物無法結(jié)合作用靶位而造成菌株耐藥。而在腸球菌中的耐藥決定基因研究中發(fā)現(xiàn)，optrA決定基因[4]以及由新型poxtA基因[13]介導(dǎo)的耐藥檢出越來越多，從而揭示革蘭陽性菌對利奈唑胺耐藥機制的多元化。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，獲得cfr基因或 23S rRNA G2576T突變是導(dǎo)致凝固酶陰性葡萄球菌對利奈唑胺耐藥的主要機制[11]，并存在江蘇地區(qū)內(nèi)的克隆傳播[8]。而在腸球菌屬尤其是糞腸球菌耐藥監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，利奈唑胺耐藥率呈逐年上升趨勢，optrA是主要決定基因[4]。本次調(diào)查尿路分離利奈唑胺不敏感糞腸球菌中發(fā)現(xiàn)，23株不敏感菌株中19株MIC大于等于8 μg/mL，其中13株檢出optrA基因。由此可見，造成尿路感染利奈唑胺耐藥糞腸球菌主要由optrA基因介導(dǎo)耐藥。當(dāng)然，可能存在其他未知機制共同介導(dǎo)。

腸球菌感染及其致病性與其攜帶毒力因子有關(guān)。目前認(rèn)為腸球菌黏附和致宿主細(xì)胞損傷相關(guān)的毒力基因主要有：esp基因編碼腸球菌表面蛋白，對于細(xì)菌黏附、定植、侵襲免疫系統(tǒng)及生物膜形成均發(fā)揮重要作用[14]；asa1基因編碼一種腸球菌表面結(jié)合蛋白，介導(dǎo)細(xì)菌的聚集和質(zhì)粒的傳遞，增加在宿主細(xì)胞的附著能力；hyl基因編碼透明質(zhì)酸酶，協(xié)助細(xì)菌在組織內(nèi)擴散；gelE基因編碼明膠酶，溶解宿主細(xì)胞的膠原蛋白或組織蛋白，使宿主細(xì)胞喪失完整性，有利于腸球菌及其致病物質(zhì)向組織周圍擴散[15]；cylA基因編碼細(xì)胞溶血素，可溶解細(xì)胞，發(fā)揮毒性作用并加重腸球菌感染的嚴(yán)重程度[16]，同時與尿路感染糞腸球菌的生物膜形成有關(guān)[17]；agg基因編碼膠原黏附蛋白等。本研究對造成尿路感染糞腸球菌攜帶毒力基因調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，主要攜帶asa1(81.9%，59/72)、esp(75%，54/72)、cylA(72.2%，52/72)、gelE(62.5%，45/72)和agg(19.4%，14/72)基因。所攜帶毒力基因的功能發(fā)揮可能與尿路感染過程中細(xì)菌生物膜形成及侵襲性感染有關(guān)[14-18]。而對LZD不敏感和敏感菌株的毒力基因分析發(fā)現(xiàn)，LZD敏感菌株中cylA和gelE基因檢出率高于LZD不敏感菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示，敏感菌株較不敏感菌株所攜帶的毒力基因更多，其致病性更強；而菌株在獲得利奈唑胺耐藥的同時，可能丟失部分的毒力基因和致病性減弱。具體的機制有待增補菌株數(shù)量及深入研究。

綜上，造成尿路感染糞腸球菌對利奈唑胺不敏感主要由optrA基因介導(dǎo)；尿路分離利奈唑胺不敏感糞腸球菌在cylA和gelE基因攜帶率上低于敏感菌株，具體機制仍需進一步研究。本研究數(shù)據(jù)對于更好地研究利奈唑胺耐藥糞腸球菌在尿路中致病機制奠定理論依據(jù)。