內毒素血癥大鼠肝臟RAS表達與肝功能損傷的關系

李晶鈴，陰赪宏

內毒素血癥是由于病原菌釋放大量內毒素至血液而引起的，以多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)為主要病理特征的一系列綜合征[1-2]。肝臟是人體內最大的解毒器官，也是內毒素代謝的主要場所，極易受到內毒素攻擊，這也是內毒素血癥常常并發肝功能障礙的主要原因[3]。既往研究[4-5]表明，腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system, RAS)在膿毒癥導致的器官損傷中介導重要機制。在膿毒癥動物模型中，有學者發現肝臟亦存在著局部RAS系統，該系統以血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)為主要效應分子，通過與肝細胞膜的血管緊張素1型受體(angiotensin type 1 receptor, AT1R)結合而增加血管緊張素原的轉錄與翻譯，從而形成自身反饋機制，引起惡性循環和不斷放大的炎性級聯反應[6]。該研究重點分析肝損傷和RAS表達的相關性，以進一步明確其病理機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康清潔級(specific pathogen free, SPF)Wistar大鼠90只， 6～8周齡，體質量250～280 g，購自中國醫學科學院實驗動物中心(動物合格證號：44007200004126，許可證號：SCXK(京)2018-0005)。本研究方案經北京友誼醫院動物倫理委員會審批(批號：TUH18260001)，符合實驗室動物管理與使用準則。

1.2 試劑與儀器智能放免測量儀(上海原子能研究所日環儀器廠)；小型垂直電泳與電轉印裝置(美國Bio-Rad公司)；高速低溫離心機(美國SIGMA 公司)；一氧化氮(nitric oxide, NO)化學法試劑盒、內皮素(endothelin, ET)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase, LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme Ⅱ, ACE Ⅱ)試劑盒購自海軍總醫院；血管緊張素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ, Ang Ⅰ)、Ang Ⅱ、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素(IL)-10試劑盒購自北京市福瑞生物工程公司；AT1R及內參引物購自美國Santa Cruz公司；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購自美國Sigma公司。

1.3 模型制備與取樣方法所有大鼠，適應性飼養一周，隨機分為9組，對照組10只和模型組8個亞組(注射后2、4、8、12、24、48、72 h和7 d共8個時間點)，模型組腹腔注射10 mg/kg LPS，對照組注射等體積無熱原水。對照組于注射后8 h取樣，模型組各個亞組以注射時為0點計時，分別于注射后2、4、8、12、24、48、72 h及7 d時取樣，1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，取心臟血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心取血清，-20 ℃存儲。之后摘取肝臟，并分兩種樣本保存，一種制備為石蠟切片樣本，另一種液氮保存。

1.4 血清學指標檢測所得血清，采用內毒素測定儀測定內毒素水平；采用硝酸還原酶法測定NO水平；采用全自動放射免疫分析儀和ELISA試劑盒測定NOS、TNF-α、IL-10的血清水平，以及肝功能標志物ALT、AST、LDH的血清水平。

1.5 肝臟組織HE染色與病理評分隨機抽取大鼠1只/組，取肝臟組織，制備病理切片，HE染色，顯微鏡下觀察肝臟病理評分。評分標準：0分：肝組織結構正常，細胞排列規則，無壞死和炎性浸潤；1分：肝細胞點狀壞死，存在散在的炎性浸潤和嗜酸小體；2分：肝細胞片狀或灶狀壞死，但壞死范圍在小葉1/3內；3分：肝細胞廣泛壞死，占小葉1/3～2/3；4分：肝細胞廣泛壞死，超過小葉2/3。

1.6 組織學指標檢測所得肝臟組織，分為兩部分，一部分采用ELISA實驗測定ACE、Ang Ⅱ、AT1R水平；另一部分采用RT-qPCR實驗測定AT1R mRNA表達。RT-qPCR實驗的主要步驟：采用TRIzol總RNA抽提試劑盒提取組織的總RNA，所得RNA以DEPC水配置為1 μg/μl的溶液。采用核酸蛋白儀測定A260/A280的相對吸光度，1.8～2.2之間的為純凈度良好。再取2 μl RNA溶液，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，90 V電泳30 min，采用凝膠成像分析系統觀察18S和28S的條帶亮度，條帶清晰且28S/18S≥2為完整度良好。將合格產品納入反轉錄實驗，PCR儀中操作，常規反轉錄體系和條件生成cDNA。進行PCR擴增實驗，AT1R引物上游序列：5′-GGC GCG GGT TTG ATA TTT GAC A-3′，下游序列：3′-CAA AGG GCC AGC GGT ATT CCA TAG-5′。擴增條件：預變性，95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40 個循環。反應結束后確認擴增曲線和融合曲線，以2-ΔΔCt法計算表達量。

2 結果

2.1 血清應激和炎性介質的比較模型組大鼠循環LPS在注射后迅速升高，于2 h時達峰，7 d時降至正常水平，中間時間段均高于對照組(P<0.05)。TNF-α和IL-10在注射后也迅速升高，于2 h時達峰；TNF-α和IL-10分別在8、12 h時降至正常水平，中間時間段均高于對照組(P<0.05)。NO與NOS在注射后逐漸升高，12 h時達峰；NO在4～48 h時高于對照組，NOS在2～48 h時高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠應激和炎性介質水平變化

2.2 肝臟病理觀察對照組在注射前、注射后48 h和7 d三個時間點，肝臟形態正常，細胞排列整齊，肝組織病理評分基本為0，均無肝細胞變性及壞死現象；模型組注射前，大鼠肝臟形態正常，細胞排列整齊，注射后2 h和4 h時，也未發現明顯病理改變，注射后48 h，細胞出現變形和壞死，胞核增大，炎性細胞灶狀浸潤，評分為(1.5±0.5)分；注射后7 d，細胞廣泛壞死，炎性細胞廣泛浸潤，評分為(3.3±0.6)分。見圖1。

圖1 兩組大鼠各個時間點肝臟病理HE染色后觀察 ×200A:對照組；B:注射后2 h；C:注射后4 h；D:注射后8 h；E: 注射后48 h；F:注射后7 d

2.3 肝功能標志物的比較模型組大鼠的循環AST、ALT及LDH水平在LPS注射后即逐漸升高，8 h時達峰；AST與LDH在4～48 h時均高于對照組，ALT在2～72 h時均高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝功能標志物的比較

2.4 循環RAS水平的比較模型組大鼠的循環PRA在注射后2 h顯著升高，之后逐漸降低，在48 h內的水平均高于對照組(P<0.05)。ACE和Ang Ⅱ在注射后也呈現出先增后減的變化趨勢，ACE在2～24 h時，Ang Ⅱ在2～48 h時均高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠循環RAS水平比較

2.5 肝組織RAS水平的比較模型組大鼠肝臟PRA在注射后2 h顯著升高，之后逐漸降低，在48 h內的水平均高于對照組(P<0.05)。ACE、Ang Ⅱ、AT1R水平也呈現出先增后減的趨勢；ACE在2～24 h，Ang Ⅱ在2～48 h，AT1R在4～48 h時高于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠肝臟RAS水平比較

3 討論

內毒素血癥是一組由血液中內毒素積聚而引發的全身炎癥反應綜合征，極易引發多器官功能障礙綜合征，RAS過度激活是內毒素血癥導致多器官功能障礙的重要機制之一[7]。本研究在前期也已證實LPS誘導的內毒素血癥中，腎臟損傷、心臟損傷均伴隨有RAS的參與。肝臟亦存在著局部RAS，以Ang Ⅱ為主要效應分子，通過與肝細胞膜上面的AT1R結合增強血管緊張素原表達，進一步促進ACE合成和Ang Ⅰ、Ang Ⅱ的產生，形成一種肝臟內部的自身反饋機制，在包括肝纖維化、脂肪肝、病毒性肝炎、肝癌、化療所致肝損傷等多種肝臟疾病中發揮了重要作用[8-10]。然而，關于肝臟系統中RAS是否參與了內毒素血癥所致肝功能損傷，目前報道較為少見。

本研究表明，模型組大鼠在LPS注射后，應激和炎性介質成數十倍增長，這與其他學者的報道[11]結果基本一致。既往研究[12]指出，LPS進入循環系統后被多種免疫細胞俘獲并發生免疫應答，其中巨噬細胞活化后可產生大量炎性因子，包括TNF-α、IL-6和IL-10等，其中TNF-α和IL-6還是凋亡信號通路的重要介質，NF-κB/TNF-α和IL-6/STAT3等信號的激活可進一步促進細胞凋亡與組織損傷。在內毒素血癥中，炎性損傷與氧化應激相輔相成，共同參與組織破壞，TNF-α積聚后可促進中性粒細胞脫顆粒釋放氧自由基，誘發與加重氧化應激損傷，而氧化應激產生的大量中間產物如白三烯、血栓素A2等都是強效促炎介質，可促進炎性因子的產生，從而形成瀑布級聯反應[13]。因此應激和炎性介質的升高證實內毒素血癥模型制備相對成功。

肝臟病理觀察結果顯示模型組大鼠在注射后48 h，肝臟組織有較為嚴重的損傷，且注射結束后的7 d損傷程度并未見恢復，這說明內毒素血癥引發的肝臟損傷可能是不完全可逆的。本研究顯示模型組大鼠在LPS注射后肝功能標志物均有較大幅度的升高，注射后4～48 h之間的水平均高于對照組。有研究指出，作為代謝和解毒的主要場所，肝臟也是內毒素血癥最易受累的器官之一，為分析肝臟內部的RAS變化，本研究進一步測定了循環系統和肝組織的PRA、ACE、Ang Ⅱ及AT1R。在RAS中，Ang Ⅰ來源于血管緊張素原，并進一步在ACE的催化作用下形成Ang Ⅱ，Ang Ⅱ是該系統的主要效應分子，可與受體結合，調節血壓、血管張力和水電解質的代謝等活動[14]，這也是本研究選擇ACE、Ang Ⅱ、AT1R的重要原因。本研究結果顯示RAS的變化趨勢與肝功能損傷趨勢基本一致，這說明在內毒素血癥所致肝臟損傷機制中，RAS可能也是重要的參與者。

綜上所述，該研究分析了內毒素血癥大鼠模型發病的不同時間點肝功能損傷及局部RAS的變化，結果顯示肝臟損傷過程中均伴隨著局部RAS表達異常。研究認為內毒素血癥所致肝損傷中可能有局部RAS的參與。