c.1311C>T和c.1004C>A與廣西G6PD缺乏癥的發病風險相關性

石 鳳，滕元姬, 何麗橋, 李 蘭, 李光景, 仇雯麗, 王春芳, 王俊利

先天性溶血性貧血包括紅細胞酶異常、紅細胞膜異常和血紅蛋白異常，其中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD) 缺乏癥是常見的因紅細胞酶異常而引起的溶血性疾病[1]。G6PD是以X染色體連鎖不完全的顯性遺傳性溶血性疾病，俗稱“蠶豆病”， 臨床表現為G6PD酶表達水平降低，在中國南方廣東、廣西地區的發病率較高。由于其遺傳特性，在男性患者的發病率明顯高于女性患者[2]。G6PD酶表達水平不足可影響紅細胞的不穩定性，導致紅細胞氧化損傷、引起溶血反應，嚴重者可引起高膽紅素血癥進而產生神經毒性，威脅患者生命健康[3]。G6PD基因突變可能會引起G6PD酶表達水平降低，廣西最常見的突變基因位點包括95A>G、1376G>T、1388G>A[4]。該研究分析G6PD基因c.1311C>T和c.1004 C>A位點突變與G6PD缺乏癥和酶表達水平的相關性，探討該位點突變是否會引起表型改變，為G6PD缺乏癥提供實驗數據支撐，為篩查G6PD缺乏癥患者提供更加全面的檢測指標。

1 材料與方法

1.1 研究對象隨機選取2017年1月—2019年6月經確診的417 例G6PD缺乏癥患者作為病例組，并選取同期進行G6PD篩查的295例健康人群作為對照組，其中，病例組男性261例，女性156 例；對照組男性98例，女性197例。病例組年齡為1～90(35.05±22.33) 歲，對照組年齡為1～86(36.11±18.48)歲，兩組年齡差異不具有統計學意義(P=0.491)。所有研究樣本均于右江民族醫學院附屬醫院檢驗科檢測，并經臨床醫師診斷確診。本研究的所有研究對象均經受試者本人知情同意并簽署知情同意書。

1.2 全基因組DNA提取采集受試者EDTA-K2抗凝全血2 ml，3 000 r/min離心5 min，去掉上清液，吸取20 μl壓積紅細胞于1 ml去離子水完全溶解，使用G6PD酶檢測試劑盒(上海執誠生物科技有限公司)，采用日立7600-series全自動生化分析儀 (日本株式會社日立高新技術公司) 檢測G6PD酶活性的表達。再提取全基因組DNA，于-80 ℃超低溫冰箱保存待測。

1.3 多重單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)分型檢測使用SNPscanTM多重SNP方法對G6PD SNP c.1311C>T和c.1004C>A進行分型。操作步驟為：① 設計3條探針引物序列，包括5′端的通用引物序列和等位基因鑒別引物序列，以及1條3′端特異性序列、位點鑒別連接序列。兩個等位基因特異性鑒別序列與通用引物連接生成產物基因型，引物序列如表1所示。② 高溫處理短片段基因組DNA并與探針混合物變性復性。③ 加入連接酶反應體系，特異性連接同一模板上緊鄰的配對探針，生成連接產物。④ 通過熒光標記的通用引物擴增連接產物，使用熒光毛細管電泳鑒別不同長度的擴增產物，通過其峰譜鑒定不同位點的基因型。PCR反應程序為：98 ℃、2 min；94 ℃、20 s，62 ℃、40 s，72 ℃、1.5 min，9個循壞；94 ℃、20 s，57 ℃、40 s，72 ℃、1.5 min，25個循壞。

表1 c.1311C>T和c.1004C>A引物序列

1.4 統計學處理G6PD病例組和對照組的基因型和等位基因頻率采用SPSS 22.0統計所得，兩組的基因型和等位基因分布差異通過Logistic回歸計算，并經年齡和性別校正計算P值和風險值。通過在線SHEsis軟件計算兩個SNPs位點的單倍型分布頻率。檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 G6PD病例組與對照組的性別差異比較本研究納入對象共712例，病例組男性261例，占62.6%，女性156例，占37.4%；對照組男性98例，占33.2%，女性197例，占66.8%。與對照組相比，病例組男性發病率升高(62.6%)，差異具有統計學意義(P<0.001，OR=3.363, 95%CI=2.459～4.600)。

2.2 兩組G6PD SNP比較本研究選取G6PD基因兩個多態性位點c.1311C>T和 c.1004C>A進行基因型和等位基因比較，如表2所示，在病例組和對照組中， c.1311C>T位點的基因型TT和CC+CT和等位基因T與G6PD缺乏癥的發病風險降低有關[TTvsCC:(P=0.001,OR=0.373, 95%CI=0.204～0.683); TTvsCC+CT:(P=0.001,OR=0.371, 95%CI=0.203～0.678); TvsC:(P=0.002,OR=0.601, 95%CI=0.435～0.829)。然而，c.1004C>A位點的基因型和等位基因在兩組間的分布頻率差異無統計學意義。

表2 兩組間G6PD SNPs基因型和等位基因分布頻率比較[n(%)]

2.3 G6PD SNP與G6PD酶表達水平的相關性檢測G6PD病例組和對照組兩組G6PD酶的表達水平，并比較G6PD SNP c.1311C>T不同基因型之間G6PD的表達水平差異，研究結果顯示，G6PD病例組的G6PD酶表達水平低于對照組(P<0.001)，見圖1A。在G6PD病例組中，相對于c.1311基因型TT和c.1311基因型CC患者，攜帶c.1311基因型CT患者有較高G6PD酶表達水平(P<0.001)，見圖1B，但其仍低于對照組c.1311基因型 CT的表達水平(P<0.001)，見圖1C。

圖1 c.1311C>T基因多態性與G6PD酶表達水平A：兩組的G6PD酶表達水平差異；與對照組比較：***P<0.001；B：病例組G6PD基因多態性位點c.1311不同基因型的G6PD酶表達水平差異；C：對照組和病例組CT的G6PD酶表達水平差異；與CC組比較：△△△P<0.001；與CT組比較：###P<0.001；與對照組比較：***P<0.001

2.4 G6PD SNPs單倍型分析將本研究G6PD突變的兩位點c.1311C>T和c.1004C>A進行在線SHEsis單倍型分型。結果顯示，該兩多態性位點有3種單倍型組合，包括C-C、T-C和T-A，主要為C-C單倍型，在G6PD病例組和對照組分別占89.6%和82.9%。C-C單倍型在兩組間差異具有統計學意義，攜帶C-C單倍型與G6PD缺乏癥發病風險增加有關(P<0.001,OR=2.057, 95%CI=1.494～2.832)，而攜帶T-C單倍型與G6PD缺乏癥發病風險降低有關 (P<0.001,OR=0.486, 95%CI=0.353～0.669)。見表3。

表3 病例組和對照組的G6PD SNP單倍型分析[n(%)]

3 討論

G6PD酶是在磷酸戊糖途徑中的關鍵酶，能使反應產物還原型輔酶Ⅱ作為保持谷胱甘肽還原性的供氫體，維持紅細胞的穩定性。2017年，中國G6PD缺乏癥的總體發病率達到0.77%，而新生兒G6PD缺乏癥發病率高達3.39%，其中山西的發病率最低，而廣西的發病率最高[5]。G6PD酶缺陷引起患者嚴重溶血反應、高膽紅素血癥和神經性腦病。既往研究[6]表明SNP影響基因功能。G6PD缺乏癥主要是由于基因突變以及遺傳因素導致G6PD酶表達活性或表達水平降低引起，G6PD位于X染色體長臂，遺傳方式呈X連鎖不完全顯性遺傳。男性只有一條X染色體，女性有兩條X染色體。因此，男性只要發生G6PD染色體變異即呈致病表現。男性發病率較女性高。然而，G6PD酶缺陷患者在沒有外源誘導發病機制時不發病，如蠶豆、某些化學藥物等[7]。在廣西人群中，常見的G6PD突變位點包括c.95A>G、c.871G>A、c.1024C>T、c.1376G>T和c.1388G>A[5]。c.1311C>T是指G6PD基因11外顯子發生C→T突變。近年來，研究[8-10]表明c.1311C>T聯合其他多態性位點的單倍型分型與G6PD酶活性降低有關。廣西地區處于多種遺傳性疾病的高發地區。因此，研究廣西群體的基因多態性具有重要價值。

該研究檢測了G6PD酶缺陷患者的c.1311C>T和c.1004C>A兩位點。結果顯示，在該研究群體中，男性G6PD發病風險高于女性患者，相對于對照組，G6PD缺乏癥患者的G6PD酶表達水平顯著降低；相對于c.1311基因型TT和CC患者，攜帶c.1311基因型CT患者有較高的G6PD酶表達水平，然而，c.1311基因型CT患者的G6PD酶表達水平仍比正常組人群的G6PD表達水平低。該研究顯示c.1004C>A與G6PD的發病風險無關。將c.1311C>T和c.1004C>A位點聯合進行單倍型分析，結果顯示，單倍型C-C與G6PD發病風險增加有關，而單倍型C-T與G6PD發病風險降低有關。c.1004C>A是國內少見的G6PD基因突變類型，在李文瑞等[11]研究結果中，672例G6PD缺乏癥患者出現c.1004C>A基因突變例數僅有6例。在該研究中，共檢出c.1004C>A基因突變8例，其中包括4例雜合子突變CA和4例純合子突變AA。以往研究[12]表明G6PD基因c.1311的等位基因C突變為T，其氨基酸及蛋白并未發生改變，屬于同義突變，與G6PD缺乏無關，并且該基因突變位點主要出現于地中海貧血性疾病中。然而，該研究c.1311C>T位點突變降低G6PD疾病的發病風險，并且本研究群體的疾病診斷排除了地中海貧血。然而，該基因位點不同基因型的G6PD表達水平存在統計學差異，與以上研究結果不一致。其可能原因：第一，G6PD病例組研究群體所選樣本均來自長期居住在廣西地區，可能存在影響該位點的遺傳特異性；第二，病例組人群可能存在其他位點的基因突變，影響c.1311C>T位點突變結果以及干擾G6PD表達水平。