185例結直腸神經內分泌腫瘤的臨床病理特征和預后分析*

陳浩竹 張靖宜 陳帥 郭玉虹 羅燁 丁婷婷 孫燕

神經內分泌腫瘤（neuroendocrine neoplasms，NENs）是一組起源于肽能神經元和神經內分泌細胞的異質性腫瘤。消化系統腫瘤世界衛生組織（WHO）分類第5 版（2019年）更新了消化系統NENs 分類標準，將NENs 分為神經內分泌瘤（neuroendocrine tumor，NET）G1、NET G2、NET G3、神經內分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC）和混合性神經內分泌-非神經內分泌腫瘤（mixed neuroendocrine-non-neuroendocrine neoplasm，MiNEN）[1]。雖然消化系統NENs使用相同的分類標準，但是不同器官的NENs 在發病率、發生發展機制、分期和治療中存在一定差異。本研究收集185 例結直腸NENs 臨床資料，依據新版WHO 分類進行分析，旨在探討中國結直腸NENs 的臨床病理特征及預后因素。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2011年3月至2020年12月于天津醫科大學腫瘤醫院行根治性手術和局部切除的結直腸神經內分泌腫瘤（colorectal neuroendocrine neoplasms，CRNENs）患者185例，其中男性117 例、女性68 例，平均年齡（57.3±9.2）歲。收集根治性手術切除患者的臨床病理及隨訪信息。本研究經本院倫理委員會審批通過。

病例納入標準：1）在本院行結腸/直腸根治性手術和局部切除手術的病例；2）術后病理確診為CRNENs；3）具有神經內分泌標志物及Ki-67 免疫組織化學結果。排除標準：1）僅有活檢、但未在本院行手術治療；2）未經病理證實；3）免疫組織化學結果不全。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 每例患者的腫瘤組織經福爾馬林固定、石蠟包埋，均行兔抗人Syn（EP158，北京中杉金橋）、鼠抗人CgA（LK2H10，北京中杉金橋）及兔抗人Ki-67（MIB-1，丹麥Dako 公司）免疫組織化學染色，并根據鑒別診斷的需求補充其他指標的免疫組織化學染色。所有石蠟標本制成4 μm 切片后常規脫蠟，枸櫞酸鈉抗原修復，加入3%過氧化氫封閉10 min后按照說明書常規進行免疫組織化學染色。

1.2.2 分類標準 根據消化系統腫瘤WHO 分類第5 版（2019年）消化系統神經內分泌腫瘤的分類標準[1]，分化好，核分裂象<2/2 mm2和（或）Ki-67 指數<3%判定為NET G1；分化好，核分裂象為（2～20）/2 mm2和（或）Ki-67 指數為3%～20%判定為NET G2；分化好，核分裂象>20/2 mm2和（或）Ki-67 指數>20% 判定為NET G3；分化差，核分裂象>20/2 mm2和（或）Ki-67 指數>20% 判定為NEC；MiNEN 是由形態及免疫組織化學可辨的神經內分泌腫瘤和非神經內分泌腫瘤共同組成，且每種成分≥30%。當核分裂象與Ki-67 指數的分類不一致時，以級別高者為準。

1.2.3 觀察指標及隨訪 1）主要觀察指標：患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、腫瘤浸潤深度、是否出現淋巴結及遠處轉移、美國癌癥聯合委員會（AJCC）分期及術后輔助治療情況，免疫組織化學染色結果；2）隨訪：電話或門診隨訪，隨訪時間截至2021年3月。隨訪內容包括患者術后輔助治療情況、腫瘤局部復發和遠處轉移情況、生存情況。無進展生存期（progress-free survival，PFS）定義為患者初次接受手術至術后首次確診腫瘤進展（復發或轉移）的時間。總生存期（overall survival，OS）定義為患者初次接受手術至術后因CRNENs 死亡的時間。

1.3 統計學分析

采用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析。計量資料以xˉ±s表示，組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗、連續校正法或Fisher’s確切概率法。單因素生存分析采用Kaplan-Meier法，多因素生存分析采 用Cox 回歸。以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CRNENs 的分類

在185 例病例中，46 例為結直腸根治切除標本，139 例為局部切除標本。在根治性切除標本中，13 例（28.3%）為NET G1，8 例（17.4%）為NET G2，3 例（6.5%）為NET G3，14 例（30.4%）為NEC，8 例（17.4%）為MiNEN。在局部切除標本中，129 例（72.8%）為NET G1，10 例（7.2%）為NET G2。在全部標本中，142 例（76.8%）為NET G1，18 例（9.7%）為NET G2，3 例（1.6%）為NET G3，14 例（7.6%）為NEC，8 例（4.3%）為MiNEN。

2.2 NET G1 病例的臨床病理特征

在13 例行根治性切除術的NET G1 患者中，男女比例為3.3∶1，平均年齡（55.4±10.1）歲，Ki-67 指數<1%、1%、2% 分別為5 例（38.5%）、4 例（30.8%）、4例（30.8%）。診斷時浸潤肌層5 例，其中2 例伴有淋巴結轉移（圖1A），全部病例均未發現遠處轉移。患者術后均未行進一步治療（表1）。截至隨訪結束全部患者未出現進展或死亡。

129 例NET G1 局部切除標本中，男女比例為1.6∶1，平均年齡（49.7±12.5）歲。128 例（99.2%）位于直腸、1 例（0.8%）位于結腸，腫瘤最大直徑<1 cm、1～2 cm、>2 cm 分別為81 例（62.8%）、47 例（36.4%）、1例（0.8%）。Ki-67 指數<1%、1%、2% 分別為44 例（34.1%）、62 例（48.1%）、23 例（17.8%）。

2.3 NET G2 病例的臨床病理特征

在8 例根治性切除NET G2 中，男女比例為3∶1，平均年齡（58.4±9.2）歲，平均Ki-67 指數為（4.9±2.2）%。診斷時即出現淋巴結轉移3 例，其中1 例同時伴有肝轉移（圖1B）。6 例未行術后輔助治療，截至隨訪結束未出現腫瘤進展或死亡；另2 例進行了術后輔助治療，其中1 例Ⅲ期患者術后給予長效奧曲肽治療，隨訪過程中出現肝、骨轉移（PFS 為12 個月），隨訪結束仍生存；1 例診斷時即發現肝轉移的Ⅳ期患者，進行了同期轉移病灶切除，并在術后予以奧沙利鉑化療+貝伐珠單抗靶向治療及肝射頻消融治療，截至隨訪結束未出現進展或死亡（表1）。

10 例局部切除標本中男女比例為1∶1.5，平均年齡（49±11.4）歲，均位于直腸，腫瘤最大直徑<1 cm、1～2 cm、>2 cm 分別為6 例（60.0%）、3 例（30.0%）、1 例（10.0%），平均Ki-67 指數為（4.3±2.2）%。

2.4 NET G3 病例的臨床病理特征

3 例NET G3（圖1C），均為男性，均進行根治性手術切除。2 例腫瘤位于直腸，其中1 例腫瘤的最大直徑3 cm，Ki-67 指數為50%，侵至深肌層，腸旁淋巴結可見癌轉移，術后予以EP 方案（依托泊苷+順鉑）化療，截至隨訪結束未出現進展或死亡；另1 例于術前腸鏡活檢和肝穿刺活檢病理確診直腸NET G3 肝轉移（原發病灶和轉移病灶Ki-67 指數分別為25%、50%）后，進行替莫唑胺+卡培他濱+干擾素治療，隨后進行直腸前切除+肝段切除，術后予以長效奧曲肽、干擾素及肝射頻消融治療，截至隨訪結束未出現進展或死亡。1 例腫物位于左半結腸，腫物最大直徑1.5 cm，Ki-67 指數為35%，侵犯黏膜下層，未出現淋巴結及遠處轉移，術后曾于外院行2 個周期化療（患者自述具體藥物不詳），后因化療反應停藥，截至隨訪結束未出現進展或死亡（表1）。

表1 46 例CRNENs 根治性切除病例的臨床病理特征 n（%）

2.5 NEC 病例的臨床病理特征

14 例NEC 均為根治性手術標本，男女比例為2.5∶1，平均年齡（58.5±6.7）歲。其中大細胞型12 例（圖1D）、小細胞型2 例（圖1E）。腫物最大直徑為2.5～12（5.1±2.4）cm，Ki-67 指數為55%～90%（58.5%±6.7%），其中55%～69%、70%～80%、>80% 分別為2 例（14.3%）、9 例（64.3%）、3 例（21.4%）。診斷時即出現淋巴結轉移10 例，其中4 例同時出現遠處轉移。依據AJCC 第8 版結直腸癌分期標準，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為0、3 例（21.4%）、7 例（50.0%）、4 例（28.6%）。3 例Ⅱ期患者中，1 例術后于外院給予化療（患者自述具體藥物不詳），截至隨訪結束未出現進展或死亡，其余2 例未進行術后輔助治療，隨訪結束時未出現進展或死亡。7 例Ⅲ期患者中，1 例術后行FOLFOX 方案（氟尿嘧啶+亞葉酸鈣+奧沙利鉑）化療，隨訪過程中復發（PFS 為8 個月），后失訪；1 例術后EP 方案化療，隨訪過程中發生肝、腎轉移（PFS 為1 個月），隨訪結束時死亡（OS 為11 個月）；1 例術后CE 方案（依托泊苷+卡鉑）化療，隨訪過程中復發（12 個月），隨訪結束時死亡（OS 為18 個月）；其余4 例未進行術后輔助治療，隨訪過程中時2 例發生轉移后死亡，1 例截至隨訪結束未出現進展或死亡，1 例失訪。4 例Ⅳ期患者中，1 例術后給予EP 方案化療，隨訪過程中復發（PFS 為11 個月），隨訪結束時死亡（OS 為12 個月）；2 例患者術后僅予以對癥支持治療，其中1 例出現骨轉移（PFS為1 個月），隨訪結束時死亡（OS 為4 個月），1 例失訪；另有1 例未進行任何術后治療，截至隨訪結束時死亡（OS 為1 個月），見表1。

2.6 MiNEN 病例的臨床病理特征

8 例MiNEN 均為手術標本，病理類型均為混合性腺神經內分泌癌（圖1F），其中神經內分泌癌成分為大細胞型7 例、小細胞型1 例，腺癌成分中分化腺癌2 例、中-低分化腺癌3 例、低分化腺癌3 例。男女比例為1∶1，平均年齡（60.5±11.4）歲。腫瘤最大直徑為2～9（4.5±2.5）cm。神經內分泌成分的Ki-67 指數為30%～90%（60.5±11.4）%，其中30%～69%、70%～80%、>80% 分別為1 例（12.5%）、5 例（62.5%）、2例（25.0%）。診斷時即出現淋巴結轉移5 例，其中1例同時發現肝轉移。依據AJCC 第8 版結直腸癌分期標準，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為0、3 例（37.5%）、4 例（50.0%）、1 例（12.5%）。3 例Ⅱ期患者中，1 例術前給予XELOX（奧沙利鉑+卡培他濱）新輔助化療，術后繼續術前化療方案，隨訪過程中出現肝轉移（PFS 為3 個月），隨訪結束時死亡（OS 為15 個月），其余2 例未進行術后輔助治療，隨訪結束時1 例肝、肺、盆腔轉移后死亡，1 例未出現進展或死亡。4 例Ⅲ期患者中，2 例術后予以EP 方案化療，其中1 例腹腔轉移后（PFS 為1 個月）改為IP（順鉑+伊立替康）治療，隨訪結束時死亡（OS 為18 個月），另1 例盆腔轉移后（PFS 為14 個月）失訪；2 例予以XELOX 化療，1 例骨轉移后（PFS為10 個月）死亡（OS 為11 個月），另1 例截至隨訪結束未出現進展或死亡。1 例Ⅳ期患者未進行術后輔助治療，隨訪結束時死亡（OS 為5 個月），見表1。

2.7 不同分類CRNENs 根治病例之間臨床病理參數的比較

NET G1 與NET G2、NET G1 與NET G3、NET G2 與NET G3 的臨床病理學參數差異均無統計學意義（均P>0.05，表2）。與NET G1 和G2 相比，NEC好發于結腸（χ2=5.411，P=0.031），腫瘤直徑更大（χ2=15.803，P<0.001），易發生淋巴結轉移（χ2=6.217，P=0.018），分期也較高（χ2=6.882，P=0.015）。與NET G3 相比，NEC 的腫瘤直徑更大（χ2=10.578，P=0.022），Ki-67 指數更高（t=5.569，P<0.001）。MiNEN 與NEC的臨床病理學參數均無顯著性差異（均P>0.05）；將二者作為一個整體與NET 相比，NEC/MiNEN 好發于結腸（χ2=4.305，P=0.038），腫瘤直徑更大（χ2=16.044，P<0.001），易發生淋巴結轉移（χ2=5.576，P=0.018），分期也較高（χ2=5.741，P=0.017）。

表2 46 例各類根治性切除CRNENs 病例的臨床病理參數比較分析

2.8 不同分類CRNENs 根治病例的生存分析

在全部根治性手術切除病例中，1 例NET G1 患者既往有腎透明細胞癌病史，1 例NET G2 患者有乳腺癌病史，1 例直腸NET G2 患者同時伴有直腸中分化腺癌，此3 例均不納入生存分析。在納入生存分析的43 例中，隨訪時間1～111 個月，平均時間33.5 個月。在隨訪過程中15 例（34.9%）出現復發或轉移；截至隨訪結束，12 例（27.9%）出現腫瘤相關性死亡。單因素生存分析顯示，不同WHO 分類CRNENs 患者的OS（P=0.005）和PFS（P=0.002）差異具有統計學意義（圖2）。NET G1、G2、G3 之間OS 和PFS 差異均無統計學意義。NEC 的OS（P=0.009）和PFS（P=0.003）均差于NET G1，與NETG2 的OS（P=0.113）和PFS（P=0.222）比較，差異無統計學意義；與NET G3 的OS（P=0.151）和PFS（P=0.118）比較，差異均無統計學意義。MiNEN 的OS（P=0.001）和PFS（P<0.001）均差于NETG1；OS（P=0.044）差于NET G2，PFS（P=0.117）與NET G2 比較，差異無統計學意義；PFS（P=0.045）差于NET G3，OS（P=0.077）與NET G3 比較，差異無統計學意義。NEC/MiNEN 的OS和PFS 均差于NETs（均P<0.001）。

3 討論

近年來，全球胃腸胰神經內分泌腫瘤（gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms，GEP-NENs）的發病率逐漸上升，1997年至2012年期間增加了6倍以上[2]，其中結直腸NETs 的發病率增加了10 倍[3-4]。GEP-NENs 發病率的上升與人們對該病的認識提升、分類方法逐漸規范、尤其是內鏡等檢查技術的廣泛應用有關。

WHO 消化系統腫瘤分類第5 版（2019年）[1]將神經內分泌腫瘤的分類明確為NET G1/G2/G3、NEC及MiNEN。有報道NET G3 的Ki-67 指數低于NEC[2，5-6]，但NET G3 診斷時Ki-67 指數無上限，有時單純依據Ki-67 指數和組織學形態對鑒別NET G3和NEC 不易。近年研究報道，一些分子改變能夠協助鑒別診斷GEP NET G3 和NEC。在結直腸NENs 中，出現KRAS、BRAF、p53、Rb1 突變的病例傾向于NEC[6-7]，但此結論仍需在較大的臨床樣本中進一步驗證。對NET G3 的發生發展機制進行研究，開發合適的診斷標志物，將有助于NET G3 與NEC 的鑒別診斷。

本研究結果顯示，CRNENs 以NET G1/G2 為主（G1 為76.8%，G2 為9.7%），與其他研究NET G1 為75.8%～88.1%、G2 為6.3%～11.8% 的結果基本一致[8-9]。目前尚無關于NET G3 和NEC 在總體CRNENs的發病率的數據；僅在NEC 和NET G3 中比較，本研究NET G3 占17.6%（3/17），與既往報道基本一致（5.5%～15.3%）[7，10-11]。本研究中MiNEN 占全部病例的4.3%，高于既往研究1.3%[8]，可能與本中心術后常規進行Syn、CgA 的免疫組織化學檢測，提高了MiNEN 的檢出率有關。

在臨床病理特征方面，本研究結果顯示CRNENs分級越高（NECvs.NET G1/G2、NECvs.NET G3、MiNENvs.NET）則腫瘤直徑越大；分級越高（NECvs.NET G1/G2、MiNENvs.NET）則淋巴結轉移越多見、診斷時進展期患者比例越高、越多見于結腸。其他研究也顯示分級越高越多見淋巴結轉移、分期更高、腫瘤直徑越大，且結腸較直腸更傾向于更高的分級[9，12-14]。本研究結果顯示，WHO 分類與CRNENs 患者的生存密切相關，NEC 的OS 和PFS 均差于NET G1，MiNEN的OS 和PFS 均差于NET G1、OS 差于NET G2、PFS 差于NET G3，與其他研究一致[15]。有研究顯示，結直腸NET G3 的生存要優于NEC。本研究中，CRNEC 和CRNET G3 患者的生存無顯著性差異，可能與本研究中納入生存分析的兩類病例的例數較少（分別為14 例和3 例）有關[7，12]。另外，本研究結果顯示高級別的NEC 與MiNEN 患者的OS 和PFS 均差于NETs（包括NET G1、G2、G3）患者。Zhang 等[13]研究也表明與NETs 相比，NEC/MiNEN 的生物學行為相對更惡性。

值得注意的是，無論分類如何，目前除了胰腺神經內分泌微腺瘤以外的全部NENs 被認為是惡性腫瘤[1]。本研究中，在根治性切除標本中發現有2 例NET G1 浸潤肌層并伴有淋巴結轉移。Ramage 等[12]的報道中也出現直腸<1 cm 的NET G1 浸潤至肌層并伴有淋巴結轉移的病例。上述研究強化了NET G1也是惡性腫瘤的概念，提醒臨床醫師對于內鏡下切除的分化好的NET，需要關注基底是否干凈、有無脈管侵犯、神經侵犯等危險因素，從而決定是否需要加做根治性手術；同時，對于不需要根治手術的NET 患者，也需要隨診。

目前不同類別CRNENs 的治療方案仍存在爭議。一般情況下，1 cm 以下、分化良好且無高危因素（不侵犯固有肌層或淋巴結）的直腸NET（G1、G2）可以通過內鏡進行初步治療[16]，而具有高危因素NET G1/G2 可采用生長抑素類似物（somatostatin analogs，SSA）進行抗腫瘤增殖治療[17-18]；NEC 的一線治療為EP/IP 方案[19]，二線治療方案可選擇FOLFOX[20]；而對于NET G3 的患者尚缺乏研究數據。由于NET G3的平均Ki-67 指數低于NEC，且分化較好。另外有報道，NET G3 可能來源于NET G1/G2 的進展，因此傾向于使用NET G2 的治療方案去治療NET G3[7]。因為本研究為回顧性研究，2019年以前尚無結直腸NET G3 的概念，因此本中心3 例NET G3 中2 例予以化療，僅有1 例予以SSA 類藥物治療，截至隨訪結束此3 例均未出現進展或死亡。鑒于NET G3 是新近提出的類別，且病例量少，仍需要多中心大樣本臨床研究來積累治療經驗。

綜上所述，CRNENs 的發病率逐年上升，但其發生發展機制尚未完全清楚。一些分子改變可能有助于精準診斷，但仍需在較大的臨床樣本中進一步驗證。隨著對CRNENs 這一組異質性腫瘤的認識逐漸加深、分類逐漸規范化、臨床研究的不斷積累，相信結直腸NENs 的診治將會取得更大的進步。