仙鶴草配方顆粒中槲皮素含量測(cè)定及指紋圖譜研究*

俞 杰，侯 靜，許豪杰，黃 琪，聞佳濤

（浙江佐力藥業(yè)股份有限公司研發(fā)中心，浙江 湖州 313200）

仙鶴草Agrimonia pilosaLedeb L.始載于北宋蘇頌《圖經(jīng)本草》，為薔薇科多年生草本植物龍芽草的全草，主產(chǎn)于浙江、江蘇等地［1-3］，含有黃酮類、三萜類、酚類、酯類、鞣質(zhì)類等有效成分，具有收斂止血、解毒殺蟲(chóng)、補(bǔ)虛益氣強(qiáng)心等功效［4-5］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，仙鶴草有抗腫瘤作用［6］。仙鶴草中的抗氧化成分主要有黃酮類、多酚類和鞣質(zhì)［7］，黃酮類物質(zhì)有降血糖作用［8］。對(duì)仙鶴草中黃酮類成分的研究發(fā)現(xiàn)，其主要含槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素及糖苷［8-9］。目前，《中國(guó)藥典》中暫未規(guī)定仙鶴草質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。為此，本研究中對(duì)仙鶴草標(biāo)準(zhǔn)湯劑中槲皮素含量及指紋圖譜進(jìn)行研究，為該顆粒制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；Mettler SX205 型電子分析天平（瑞士Mettler 公司，精度為十萬(wàn)分之一）；FA2004B 型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，精度為萬(wàn)分之一）；LS220A 型電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司，精度為千分之一）；KQ-500VDB型超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）。

1.2 試藥

槲皮素對(duì)照品（批號(hào)為100081-201610，含量99.1%），仙鶴草對(duì)照藥材（批號(hào)為121464-201303），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；仙鶴草配方顆粒（浙江佐力藥業(yè)股份有限公司、批號(hào)為19080162，浙江貝尼菲特股份有限公司、批號(hào)為1908024，浙江景岳堂股份有限公司、批號(hào)為YK2003006，依次記為P1，P2，P3）；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸均為分析純，水為純化水。共收集仙鶴草藥材16批（記為S1-S16，批號(hào)及產(chǎn)地見(jiàn)表1）。

表1 仙鶴草藥材的批號(hào)與產(chǎn)地Tab.1 Batch numbers and origin of Agrimonia pilosa

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸水溶液（28∶72，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：368 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 樣品及溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)湯劑：稱取藥材飲片樣品100 g，置煎藥鍋中，加水煎煮2 次，第一次加飲片量8 倍的水，攪拌，浸潤(rùn)，浸泡30 min，大火加熱至微沸，轉(zhuǎn)小火煮沸30 min，藥液用100目不銹鋼篩濾過(guò)；第2次加飲片量6倍的水，大火加熱至微沸，轉(zhuǎn)小火煎煮20 min，藥液用100 目不銹鋼篩濾過(guò)，合并2次的濾液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，50～60 ℃減壓濃縮至體積約為1∶1 的浸膏，冷凍干燥，即得飲片標(biāo)準(zhǔn)浸膏（湯劑）。

相關(guān)溶液：取槲皮素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇定容，制成質(zhì)量濃度為11.60 μg/mL 的對(duì)照品溶液。取標(biāo)準(zhǔn)浸膏樣品和配方顆粒樣品各約1.0 g，精密稱定，加甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，取出，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按樣品處方工藝取輔料，制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取配方顆粒供試品溶液（批號(hào)為19080162）、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)吸收峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，專屬性良好。詳見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察：量取2.1.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液2，4，6，8，10，20 μL，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以槲皮素質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得槲皮素回歸方程Y=56.191X-7.615 9（R2=1.000 0，n=6）。結(jié)果表明，槲皮素質(zhì)量濃度在2.32～23.19 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.1.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD小于2.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下配方顆粒供試品溶液，室溫下放置0，2，4，8，12，18，24，36 h 時(shí)，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD小于2.0%（n=8），表明室溫下供試品溶液放置36 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取2.1.2 項(xiàng)下配方顆粒供試品溶液6 份，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD小于2.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取配方顆粒樣品（批號(hào)為19080162），研細(xì)，取約0.5 g，共6 份，精密稱定，精密加入槲皮素對(duì)照品溶液50 mL，混勻，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.1.4 耐用性試驗(yàn)

考察不同色譜柱、柱溫、流動(dòng)相比例及流速對(duì)本色譜條件的耐用性，結(jié)果見(jiàn)表3。可見(jiàn)，各色譜條件發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of the durability test

2.1.5 樣品含量測(cè)定

取16 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品及3 批配方顆粒樣品，依法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品中槲皮素含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.2 Results of content determination of quercetin in the samples（mg/g，n=2）

2.2 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗 脫（0～20 min 時(shí)0%A →20%A，20～30 min 時(shí)20%A，30～40 min 時(shí)20%A →30%A，40～50 min 時(shí)30%A →40%A，50～60 min 時(shí)40%A →50%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：30 ℃。結(jié)果各峰分離度和峰形均較好。

2.2.2 參照物選擇及相關(guān)成分確認(rèn)

標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分多為黃酮類（主要有槲皮素和蘆丁等），考慮到多成分、整體質(zhì)量控制，以仙鶴草對(duì)照藥材作對(duì)照，為保持對(duì)照藥材與標(biāo)準(zhǔn)湯劑工藝基本一致，將對(duì)照藥材以水超聲提取，取對(duì)照藥材約2 g，加水25 mL，加水煎煮30 min，放冷，濾過(guò)，蒸干，加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果對(duì)照藥材與配方顆粒樣品色譜圖基本一致。

2.2.3 對(duì)照指紋圖譜建立

按國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，對(duì)16批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC 圖的色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，形成共有峰，建立對(duì)照指紋圖譜。結(jié)果見(jiàn)圖2。16 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品的指紋圖譜無(wú)明顯差異，共有5 個(gè)共有峰，相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.00%～1.09%，表明不同產(chǎn)地的飲片制成的標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有類似的化學(xué)成分，5 個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積的RSD無(wú)明顯差異，表明不同產(chǎn)地標(biāo)準(zhǔn)湯劑中化學(xué)成分含量無(wú)明顯差異。

2.2.4 相似度計(jì)算

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)（2012版）”，以共有峰計(jì)算16批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度，結(jié)果整體相似度為0.985～1.000，表明標(biāo)準(zhǔn)湯劑一致性良好。詳見(jiàn)表5。

表5 16批標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度Tab.5 Similarity of fingerprints of 16 batches of standard decoction

2.2.5 共有峰標(biāo)定

將標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC 指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”，選擇時(shí)間寬度為0.1，中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，通過(guò)分析共確定5個(gè)共有峰。與仙鶴草對(duì)照品色譜圖進(jìn)行對(duì)比，確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC 指紋圖譜中5（S）峰為槲皮素。詳見(jiàn)圖3。

2.2.6 配方顆粒檢測(cè)

取3 批配方顆粒樣品（批號(hào)依次為19080162，1908024，YK2003006），按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，圖譜見(jiàn)圖4。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照特征圖譜基本一致，重復(fù)性較好，4 批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.9。表明建立的特征圖譜可用于配方顆粒的質(zhì)量分析。

3 討論

中藥配方顆粒以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，以臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，按現(xiàn)代標(biāo)準(zhǔn)化工藝將中藥飲片制成顆粒劑，可保障用藥準(zhǔn)確性和劑量的一致性［10］。2016年，國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》（征求意見(jiàn)稿）中提出，將標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的標(biāo)準(zhǔn)參照物，用中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為標(biāo)準(zhǔn)體系，有利于保障臨床療效的一致性，可為中藥配方顆粒制備工藝的標(biāo)準(zhǔn)化和產(chǎn)品質(zhì)量的一致性提供參照［11-14］。中藥的成分復(fù)雜多樣，指紋圖譜或特征圖譜等可對(duì)多組分進(jìn)行分析，可更好地用于中藥質(zhì)量的整體性評(píng)價(jià)［15］。

本研究中基于傳統(tǒng)煎藥工藝，運(yùn)用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室方法制備仙鶴草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，以3批仙鶴草配方顆粒對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。飲片產(chǎn)地包含浙江舟山、河南信陽(yáng)、江蘇蘇州3 個(gè)產(chǎn)地，涵蓋了仙鶴草的道地產(chǎn)地和主產(chǎn)區(qū)，具有較好的代表性。由于槲皮素在仙鶴草中具有抗氧化作用和降血糖作用［11-12］，藥理作用明確，故以槲皮素作為仙鶴草配方顆粒含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。

本研究中考察了乙腈-0.2%磷酸水溶液不同比例流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)以28∶72（V/V）為宜，各峰分離度和峰形均較好，保留時(shí)間適中，故使用該方法作為流動(dòng)相。由于中藥所含黃酮、蒽醌等活性成分多數(shù)有紫外吸收，適用于光電二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)［16］。本研究中在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)供試品溶液進(jìn)行掃描，通過(guò)等吸收?qǐng)D譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)為250 nm 時(shí)效果最好，故以其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。方法學(xué)考察中，儀器精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、耐用性和中間精密度的RSD均小于3%，表明該方法準(zhǔn)確、可行、重復(fù)性良好，可用于仙鶴草配方顆粒的質(zhì)量控制。標(biāo)準(zhǔn)湯劑中槲皮素含量為2.88 mg/g，且不同產(chǎn)地樣品含量無(wú)明顯差異，但不同批次間槲皮素含量存在一定差異，可能受采收時(shí)間和貯藏方式的影響。配方顆粒中的槲皮素含量均低于標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的含量，考慮受原藥材質(zhì)量差異及制備工藝等因素的影響。后續(xù)可進(jìn)一步探更多指標(biāo)性成分及其在原藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒中的量及轉(zhuǎn)移情況。且還需從配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑及傳統(tǒng)湯劑的關(guān)聯(lián)性、差異性等方面，并結(jié)合藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理活性等多方面進(jìn)行研究，為中藥配方顆粒質(zhì)量控制體系的建立提供依據(jù)。