金茵利膽口服液高效液相色譜指紋圖譜及多成分含量同時(shí)測(cè)定研究*

趙麗娟，王 信，潘新波，李彩東

（甘肅省蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730046）

金茵利膽口服液（甘藥制備字Z20200419000）在我院臨床應(yīng)用已逾20年，由茵陳、廣金錢(qián)草、枳殼、蒲公英、黃連、甘草等18味中藥組方，主要含有蒽醌類(lèi)、生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等成分，具有疏肝利膽、清熱解毒等功效，用于治療黃疸、慢性肝炎、膽道結(jié)石、膽囊炎等癥。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)方中茵陳、枳殼、蒲公英和五味子進(jìn)行了薄層色譜定性鑒別，并測(cè)定了柚皮苷和新橙皮苷的含量［1］。本研究中參考2020年版《中國(guó)藥典（一部）》［2］及文獻(xiàn)［3-6］，采用高效液相色譜（HPLC）法構(gòu)建了21 批金茵利膽口服液的指紋圖譜，運(yùn)用主成分分析（PCA）法篩選了批次間的主要差異成分，同時(shí)測(cè)定了8 種主要有效成分的含量，為建立該制劑的質(zhì)量控制方法提供了參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；FA2004N 型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；XPE105 型電子分析天平（梅特勒托利多儀器＜上海＞有限公司）；TH-100BQ 型超聲波提取機(jī)（濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司）。

1.2 試藥

沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)為110831-200302，含量91.5%），綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為110753-201817，含量96.6%），夏佛塔苷對(duì)照品（批號(hào)為111912-201703，含量95.6%），甘草苷對(duì)照品（批號(hào)為111610-201106，含量93.7%），柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)為110722-201111，含量93.2%），新橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)為111857-201102，含量99.6%），鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為110713-201212，含量86.7%），甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)為110731-201116，含量93.1%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；金茵利膽口服液（醫(yī)院制劑室自制，批號(hào)分別為20181206，20181213，20181220，20190314，20190328，20190411，20190425，20190516，20190530，20190704，20190822，20190919，20190930，20191024，20191107，20191113，20191121，20191128，20191206，20191213，20200116，依次記為S1-S21；規(guī)格為10 mL/支）；磷酸、甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。廣金錢(qián)草（批號(hào)為19112202，廣西產(chǎn)），茵陳（批號(hào)為19090804，甘肅產(chǎn)），黃連（批號(hào)為20021002，四川產(chǎn)），厚樸（批號(hào)為20021202，四川產(chǎn)），甘草（批號(hào)為19111705，甘肅產(chǎn)），香附（批號(hào)為19031303，廣西產(chǎn)），木香（批號(hào)為20021101，云南產(chǎn)），牡丹皮（批號(hào)為20020701，河南產(chǎn)），枳殼（批號(hào)為19102106，江西產(chǎn)），桃仁（批號(hào)為19111905，山東產(chǎn)），川楝子（批號(hào)為20021001，四川產(chǎn)），山楂（批號(hào)為20021102，山東產(chǎn)），麥芽（批號(hào)為19112602，甘肅產(chǎn)），神曲（批號(hào)為20020702，甘肅產(chǎn)），南五味子（批號(hào)為19040603，廣西產(chǎn)），均購(gòu)自蘭州安泰堂藥業(yè)有限公司；大黃（批號(hào)190410，甘肅產(chǎn)），虎杖（批號(hào)為B909181-01，甘肅產(chǎn)），蒲公英（批號(hào)為190601，甘肅產(chǎn)），均購(gòu)自蘭州九州通醫(yī)藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DIKMA Diamonsil?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～34 min時(shí)93%B→71%B，34～50 min時(shí)71%B→65%B，50～60 min 時(shí)65%B→0B）；流速：0.9 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

單一對(duì)照品溶液：分別稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品3.18 mg、綠原酸對(duì)照品2.96 mg、夏佛塔苷對(duì)照品2.13 mg、甘草苷對(duì)照品5.07 mg、柚皮苷對(duì)照品29.50 mg、新橙皮苷對(duì)照品49.64 mg、鹽酸小檗堿對(duì)照品1.82 mg、甘草酸銨對(duì)照品0.51 mg，置不同25 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為沒(méi)食子酸0.116 4 g/L、綠原酸0.114 4 g/L、夏佛塔苷0.081 5 g/L、甘草苷0.190 0 g/ L、柚皮苷1.099 8 g/ L、新橙皮苷1.977 7 g/L、鹽酸小檗堿0.063 1 g/L、甘草酸銨0.019 0的單一對(duì)照品溶液，4 ℃避光保存。

混合對(duì)照品溶液：分別取沒(méi)食子酸、綠原酸、夏佛塔苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨對(duì)照品4.30，1.45，0.53，1.35，9.23，9.65，0.75，0.30 mg，精密稱(chēng)定，置同一25 mL 棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為沒(méi)食子酸0.157 4 g/L、綠原酸0.056 0 g/L、夏佛塔苷0.020 7 g/L、甘草苷0.050 6 g/ L、柚皮苷0.344 1 g/ L、新橙皮苷0.384 5 g/ L、鹽酸小檗堿0.026 0 g/ L、甘草酸銨0.011 2 g/L的混合對(duì)照品溶液，4 ℃避光保存。

供試品溶液：精密量取樣品5 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，超聲（功率為250 W，頻率為50 kHz，下同）處理10 min，放冷至室溫，稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，1 000 r/ min 離心10 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 HPLC 指紋圖譜研究

2.3.1 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液（S1）適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以柚皮苷（11 號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液（S1）適量，分別于室溫下放置0，6，12，24，36，48 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以柚皮苷為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果的RSD均小于3.0%（n=6），表明室溫下供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（S1）適量，精密稱(chēng)定，按2.2項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，以柚皮苷為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.2 特征圖譜建立及共有峰定位

取21 批樣品，按2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將所得色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，以樣品S1的HPLC 圖譜為參照，采用平均數(shù)法，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1 min，得HPLC 疊加指紋圖譜（圖1）及對(duì)照指紋圖譜（圖2）。21批樣品的色譜圖中共有18個(gè)共有峰，指認(rèn)其中8個(gè)特征峰，分別為1號(hào)峰（沒(méi)食子酸）、6號(hào)峰（綠原酸）、8號(hào)峰（夏佛塔苷）、9號(hào)峰（甘草苷）、11號(hào)峰（柚皮苷）、12號(hào)峰（新橙皮苷）、15號(hào)峰（鹽酸小檗堿）、18號(hào)峰（甘草酸銨）。21批樣品指紋圖譜相似度均在0.947～0.999（見(jiàn)表1），表明各批次樣品化學(xué)成分相似，制劑工藝穩(wěn)定。

2.4 主成分分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)樣品進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)前3個(gè)主成分（PC1，PC2，PC3）分別表征了原始數(shù)據(jù)的27.289%，22.502%，15.182%，累計(jì)64.973%的信息量，且均包含了8種化學(xué)成分組成信息。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿和甘草酸銨在PC1中得分較高，新橙皮苷在PC2 中得分最高（0.810），夏佛塔苷和沒(méi)食子酸在PC3中得分較高，說(shuō)明這5種成分的含量在不同批次樣品間有相對(duì)差異，提示在實(shí)際生產(chǎn)質(zhì)控過(guò)程中需重點(diǎn)監(jiān)測(cè)。主成分得分系數(shù)矩陣見(jiàn)表2。

表2 金茵利膽口服液主成分得分系數(shù)矩陣Tab.2 Rotated component matrix of principal components of Jinyin Lidan Oral Liquid

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與混合對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有吸收峰。理論板數(shù)按沒(méi)食子酸峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，分離度均大于1.5，基線(xiàn)分離良好。詳見(jiàn)圖3。

線(xiàn)性關(guān)系及檢測(cè)限、定量限考察：分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.5mL，置10mL容量瓶中，加50%甲醇定容，制成系列混合對(duì)照品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。以信噪比（S/N）3∶1和10∶1時(shí)的進(jìn)樣量記作檢測(cè)限和定量限。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 8個(gè)成分的線(xiàn)性關(guān)系、線(xiàn)性范圍和檢測(cè)限、定量限（n=6）Tab.3 Linear relationship，linear range，LOD and LOQ of eight components（n=6）

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄色譜圖。結(jié)果沒(méi)食子酸、綠原酸、夏佛塔苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.55%，1.31%，0.86%，0.81%，0.76%，1.31%，0.78%，0.81%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（S21），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，6，12，24，48 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果沒(méi)食子酸、綠原酸、夏佛塔苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.55%，1.10%，0.68%，1.54%，1.33%，2.68%，1.82%，1.39%（n=5），表明室溫下供試品溶液放置48 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（S21），按2.1項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果沒(méi)食子酸、綠原酸、夏佛塔苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨含量的RSD分別為1.46%，1.68%，1.85%，1.97%，1.96%，1.92%，2.76%，0.17%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的供試品溶液（S21）適量，分別加入2.2項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

2.5.2 含量測(cè)定

取8 批樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各成分的含量。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 金茵利膽口服液中8個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果（g/L）Tab.5 Results of content determination of eight components in Jinyin Lidan Oral Liquid（g/L）

3 討論

3.1 測(cè)定指標(biāo)確定

金茵利膽口服液方中君藥茵陳含綠原酸、異綠原酸、咖啡酸等有機(jī)酸［7］，廣金錢(qián)草含皂苷、黃酮苷、生物堿、多糖等成分［8-9］，可清熱除濕、利膽退黃。黃連含小檗堿等異喹啉生物堿類(lèi)，蒲公英含甾醇、有機(jī)酸等，虎杖、大黃主含蒽醌類(lèi)，共為臣藥，可利膽排石、通腑瀉熱。木香、枳殼、厚樸、桃仁等為佐藥，可疏肝行氣、化郁止痛、軟堅(jiān)散結(jié)；五味子、甘草等為使藥，可健脾和胃、調(diào)和諸藥［10］。根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典（一部）》及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［11-14］，對(duì)方中各藥材有效成分進(jìn)行峰歸屬和含量測(cè)定研究［15］，發(fā)現(xiàn)厚樸酚、和厚樸酚、丹皮酚、苦杏仁苷、甘草次酸、枸櫞酸等在制劑中無(wú)法檢出，大黃酸、大黃素等蒽醌類(lèi)成分在煎煮過(guò)程中易發(fā)生變化，最終確定以沒(méi)食子酸、綠原酸等8種成分為檢測(cè)指標(biāo)。

3.2 流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

預(yù)試驗(yàn)中考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸、乙腈-磷酸等流動(dòng)相對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%磷酸水體系為流動(dòng)相、流速為0.9 mL/min時(shí)，色譜峰峰形良好，分離度高，無(wú)雜質(zhì)干擾。全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，沒(méi)食子酸在215，271 nm 波長(zhǎng)處吸收較強(qiáng)，綠原酸在218，326 nm 波長(zhǎng)，夏佛塔苷在271，336 nm 波長(zhǎng)處吸收較強(qiáng)，柚皮苷、新橙皮苷在283 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰，鹽酸小檗堿在228，264，345 nm 波長(zhǎng)處有較大吸收峰，甘草苷最大吸收波長(zhǎng)在216，276 nm 處，甘草酸銨最大吸收波長(zhǎng)在254 nm 處。設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)210，254，326 nm，對(duì)比各峰，發(fā)現(xiàn)210 nm 波長(zhǎng)處存在強(qiáng)吸收雜質(zhì)峰，326 nm波長(zhǎng)處沒(méi)食子酸、甘草苷基本無(wú)吸收，254 nm波長(zhǎng)處色譜圖基線(xiàn)平穩(wěn)，各成分在考察范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系均良好，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

3.3 主成分分析評(píng)價(jià)

金茵利膽口服液處方含有藥材種類(lèi)多，化學(xué)成分復(fù)雜，極性差異較大，會(huì)對(duì)實(shí)際質(zhì)控檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)造成干擾。主成分分析作為一種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，在處理復(fù)雜數(shù)據(jù)降維后代替原始指標(biāo)，能較充分地反映原始數(shù)據(jù)信息的特性［16］。本研究中在構(gòu)建金茵利膽口服液指紋圖譜的基礎(chǔ)上，應(yīng)用主成分分析法對(duì)21 批樣品中8 種成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿、甘草酸銨、新橙皮苷、夏佛塔苷和沒(méi)食子酸的含量在不同批次樣本間存在一定差異。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的金茵利膽口服液指紋圖譜，及其中8種成分含量測(cè)定方法，簡(jiǎn)便快速，穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，準(zhǔn)確度較高，可用于該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)。