藏藥肺熱普清散中烏頭堿的限量檢測

馬 靜，鄒 麗△，王 曙

（1.四川省藥品檢驗研究院院·四川省醫療器械檢測中心，四川 成都 611731；2.四川大學華西藥學院，四川 成都 610041）

肺熱普清散（藏文名為洛才更賽），收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·藏藥：第一冊》［1］中，主要由天竺黃、紅花、力嘎都、叢菔、鐵棒錘幼苗等14味藏藥組方，具有清肺、泄熱、消炎功效，可用于治療小兒肺炎、流感、風熱、癘熱等。方中鐵棒錘幼苗為鐵棒錘Aconitum pendulumBusch和伏毛鐵棒錘A.flavumHand.Mazz.的干燥幼苗，為藏醫、羌醫和回醫民族習用藥材，多用于治療感冒、瘟疫、熱毒、瘡疔等［2-3］。鐵棒錘有大毒，各器官中均含有二萜生物堿，含量由高到低依次為根、果、莖、葉，母根和子根毒性雖大，但療效顯著，幼苗的毒性稍小，但療效稍次［4］。塊根中的總生物堿含量隨生長發育期的變化而不同，其中6～11月的塊根中總生物堿含量隨生長期的延長而逐漸升高，10 月的含量可達（9.07±0.92）mg/g［5-7］。肺熱普清散方中所用鐵棒錘幼苗而非塊根，說明藏醫藥前輩已注意到了該類藥材的毒性。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法對該制劑中含有雙酯型二萜類生物堿中主要成分烏頭堿進行含量限度檢測，克服了薄層色譜鑒別中樣品的雜質干擾和斑點不清晰的狀況［8-12］。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10AT型高效液相色譜儀，包括SPD-M10Avp型紫外檢測器、CLASSVP 工作站（日本Shimadzu 公司）；HWS24 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；XP205DR 型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

肺熱普清散（西藏神猴藥業有限責任公司，批號分別為171101，171102，171103，171201，171202，171203）；烏頭堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110720-200410，含量＞98.0%）；醋酸銨、乙腈、四氫呋喃為色譜純，乙醇、鹽酸、氨水、乙酸乙酯為分析純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex ODS 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L醋酸銨（A，用氨水調pH至10）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：235 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2.2 溶液制備

對照品溶液：精密稱取烏頭堿對照品14.4 mg，置100 mL 容量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）溶液溶解并定容，搖勻，制成質量濃度為0.144 mg/mL 的對照品貯備液；精密吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）溶液定容，搖勻，制得質量濃度為14.4 μg/mL的對照品溶液。

供試品溶液：取樣品20 g，用乙醇200 mL 加熱回流提取2 次，每次1 h，合并提取液，濾過，蒸干，殘渣加2%鹽酸溶液40 mL使溶解，用氨水調pH 至5；經D101大孔吸附樹脂（柱體積為50 mL），依次用水和10%乙醇150 mL 洗脫，棄去洗脫液，再用85%乙醇100 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加2%鹽酸溶液40 mL 溶解，并轉移至分液漏斗中，用氨水調pH 至10，以乙酸乙酯萃取3 次，每次40 mL，合并萃取液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，并轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

陰性對照品溶液：按處方工藝制備不含鐵棒錘幼苗的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2 項下3 種溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，理論板數按烏頭堿峰計應不低于2 000；分離度大于1.5，基線分離良好。色譜圖見圖1。

線性關系考察：取2.2 項下對照品溶液適量，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）溶液，制成質量濃度分別為4.6，8.8，24.0，48.0，72.0，144.0 μg/ mL 的系列對照品溶液。精密吸取10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以烏頭堿進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=49 878X+8 166（r=0.999 6，n=6）。結果表明，烏頭堿進樣量在0.046～1.440 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

定量限與檢測限考察：分別精密量取2.2項下對照品溶液適量，倍比稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S/N）10∶1 和3∶1 時的質量濃度記作定量限和檢測限。結果烏頭堿的定量限和檢測限分別為5.0 μg/mL和1.2 μg/mL。

精密度試驗：取2.2項下對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果烏頭堿峰面積的RSD為1.08%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密量取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果烏頭堿峰面積的RSD為1.43%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置10 h內基本穩定。

重復性試驗：精密稱取樣品（批號為171101）適量，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果烏頭堿平均含量的RSD為1.51%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為171101）適量，共6份，分別加入一定質量濃度的對照品溶液，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取6 批樣品各適量，分別按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定3 次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果見表3。

表3 樣品中烏頭堿含量測定結果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of aconitine in the samples（mg/g，n=3）

健康成人口服0.2 mg 烏頭堿可發生中毒反應，2.0～4.0 mg 即可致死。本試驗中，烏頭堿的平均含量為0.004 5 mg/g，肺熱普清散的用量為每次1 袋，每袋1 g，每日2次，故每日服用烏頭堿的量為9.0 μg，遠低于烏頭堿的中毒劑量，表明在該劑量下常規用藥合理、安全。

3 討論

肺熱普清散為藏藥，藏藥的來源多為民間草藥，由于人們對民族醫藥的認知過少，常忽略個別藥材毒副作用的危害，加之我國民族藥的有效性、安全性和毒性評價體系不健全，一直影響和制約著民族醫藥產業的發展。預試驗中測定過鐵棒錘幼苗中雙酯型生物堿（烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿），但僅檢出烏頭堿，故本研究中僅對不同來源鐵棒錘幼苗藥材中的烏頭堿進行了含量測定，并制訂了肺熱普清散中烏頭堿的限量。

預試驗中也考察了不同流動相，包括0.25 mol/ L乙酸銨溶液（用濃氨水調pH 至9.5）-乙腈（48∶52，V/V）［13］，甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀-醋酸-異丙醇（67∶173∶4∶4，V/V/V/V）［14］，甲醇-0.2 mol/ L 醋酸銨-冰醋酸（67∶33∶1，V/V/V）［15］，以及乙腈-四氫呋喃（25∶15，V/V）-0.1 mol/L 醋酸銨（梯度洗脫）［16］對結果的影響，但部分主峰與其他雜質峰不能完全分離，或陰性干擾較嚴重。故對上述流動相條件進行了優化，以0.05 mol/L 乙酸銨溶液（pH 10）-乙腈為流動相進行梯度洗脫時的效果較好，雜質無干擾。

預試驗中還考察了不同廠家的色譜柱，包括Shimpack C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm；日本Shimadzu 公司）和Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；廣州菲羅門科學儀器有限公司），結果表明，在不同色譜柱上，基線分離均較好，含量測定結果無明顯差異。

綜上所述，所建立的方法穩定可靠，重復性好，可用于測定肺熱普清散中烏頭堿的含量。