益生菌對(duì)2 型糖尿病患者恒定自然殺傷T 細(xì)胞、血糖指標(biāo)、炎性因子及腸道菌群的影響*

馮 罡，仲威振，趙 潔，王曉麗

（1.青島濱海學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，山東 青島 266000；2.浙江省立同德醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，浙江 杭州 310012）

高鹽、高糖及高脂的攝入等不良生活習(xí)慣導(dǎo)致肥胖及糖尿病（DM）等慢性代謝性疾病的發(fā)病率不斷增加，其中以2 型糖尿病（T2DM）最多見(jiàn)［1-2］。恒定自然殺傷T（iNKT）細(xì)胞為特殊免疫細(xì)胞亞群，可通過(guò)多條代謝途徑參與機(jī)體的免疫應(yīng)答及維持脂肪組織的免疫穩(wěn)態(tài)。iNKT細(xì)胞與脂肪組織炎癥密切相關(guān)，而脂肪組織炎癥是DM 發(fā)病的重要機(jī)制［3-4］。益生菌為有利于宿主的一種非致病性微生物，已被證實(shí)可改善DM 患者的糖代謝及腸道菌群失調(diào)等［5］。本研究中探討了益生菌干預(yù)對(duì)T2DM 患者的iNKT 細(xì)胞、血糖指標(biāo)、炎性因子及腸道菌群的影響，從而為防治T2DM提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合世界衛(wèi)生組織（WHO）T2DM診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)［6］；無(wú)相關(guān)治療或服藥史，且近1 個(gè)月內(nèi)未服用抗生素及微生物制劑。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)渭兘笛撬幉荒芸刂蒲牵杵は伦⑸湟葝u素治療；合并嚴(yán)重并發(fā)癥；既往有胃腸道手術(shù)史及近期有胃腸道或肝膽系統(tǒng)疾病；合并嚴(yán)重心、肝、腎功能不全，及其他內(nèi)分泌疾病及自身免疫性疾病。

病例選擇與分組：本研究為隨機(jī)對(duì)照研究。選取青島濱海學(xué)院附屬醫(yī)院和浙江省立同德醫(yī)院2018年3 月至2020年12 月收治的T2DM 患者102 例，按隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組及對(duì)照組，各51例。兩組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組患者一般資料比較（n=51）Tab.1 Comparison of the patients’general data between the two groups（n=51）

1.2 方法

兩組患者均予基礎(chǔ)治療，包括糖尿病有關(guān)的飲食運(yùn)動(dòng)等健康指導(dǎo)、他汀類(lèi)藥物調(diào)脂等，并予鹽酸二甲雙胍緩釋片（青島黃海制藥有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20040154，批號(hào)為2012159，規(guī)格為每片0.5 g），每次0.5 g，每日2 次，早晚飯后口服；阿卡波糖片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990205，批號(hào)為8J56377，規(guī)格為每片50 mg），起始劑量為每次1 片、每日3 次，以后逐漸增加至每次2 片、每日3 次，餐前口服。觀察組患者加服雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊（晉城海斯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S19993065，批號(hào)為20200906，規(guī)格為每粒0.21 g），每次3 片，每日3 次，飯后溫開(kāi)水送服。兩組患者均治療8周。

1.3 觀察指標(biāo)與療效判定標(biāo)準(zhǔn)

外周血iNKT 細(xì)胞比例及細(xì)胞因子水平：分別采集患者治療前后的空腹靜脈血各約3 mL，提取外周血淋巴細(xì)胞，加入CD3-PerCP 抗體及Vα24-Jα18FTTC 抗體后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)iNKT細(xì)胞比例。試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。將外周淋巴細(xì)胞接種到96 孔板中，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、刺激、洗滌及重懸后，加入CD3-PerCP 抗體及Vα24-Jα 18FTTC抗體，染色，在經(jīng)過(guò)孵育、洗滌、固定、重懸后，加入白細(xì)胞介素4-抗原提呈紅細(xì)胞（IL-4-APC）抗體及藻紅蛋白（IFN-γ-PE）抗體，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-4+iNKT及IFN-γ+iNKT因子水平。

血糖指標(biāo)：分別采集患者治療前后的靜脈血各約3 mL，采用血糖儀檢測(cè)外周血空腹血糖（FBG）、糖化血紅蛋白（HbA1C）及餐后2 h血糖（2 hPG）水平。

外周血炎性因子：采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)血清超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、白細(xì)胞介素6（IL-6）及脂多糖（LPS）水平，試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

腸道菌群分布：采集患者治療前后的中段大便樣本。采用定量法檢測(cè)腸道菌群變化，包括大腸桿菌、球桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌。從無(wú)菌厭氧罐內(nèi)取出1 g 糞便樣本，溶于滅菌液中，按1∶10（m/V）稀釋?zhuān)磸?fù)多次稀釋直至為原濃度的10-8，將大腸桿菌、球桿菌分別置需氧培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，雙歧桿菌、乳桿菌分別置厭氧培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。計(jì)算各培養(yǎng)基中每1 g大便中的目標(biāo)菌落數(shù)（平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×500）。

療效判定［7］：顯效，血糖指標(biāo)水平達(dá)標(biāo)或降幅≥90%；有效，血糖指標(biāo)水平降幅50%～＜90%；無(wú)效，血糖指標(biāo)水平降幅＜50%、維持不變甚至有增加。總有效=顯效+有效。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料首先采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性分析，符合正態(tài)分布的以表示，組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的則采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較行χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料組間比較行秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表2至表7。

表2 兩組患者外周血中iNKT細(xì)胞比例及細(xì)胞因子水平比較（，%，n=51）Tab.2 Comparison of the proportion of iNKT cells in peripheral blood and the cytokine levels between the two groups（，%，n=51）

表2 兩組患者外周血中iNKT細(xì)胞比例及細(xì)胞因子水平比較（，%，n=51）Tab.2 Comparison of the proportion of iNKT cells in peripheral blood and the cytokine levels between the two groups（，%，n=51）

表3 兩組患者外周血血糖指標(biāo)水平比較（，n=51）Tab.3 Comparison of peripheral blood glucose index levels between the two groups（，n=51）

表3 兩組患者外周血血糖指標(biāo)水平比較（，n=51）Tab.3 Comparison of peripheral blood glucose index levels between the two groups（，n=51）

表4 兩組患者外周血炎性因子水平比較（，n=51）Tab.4 Comparison of peripheral blood inflammatory factor levels between the two groups（，n=51）

表4 兩組患者外周血炎性因子水平比較（，n=51）Tab.4 Comparison of peripheral blood inflammatory factor levels between the two groups（，n=51）

表5 兩組患者腸道菌群水平比較［，lg（N/g），n=51］Tab.5 Comparison of intestinal flora levels between the two groups［，lg（N/g），n=51］

表5 兩組患者腸道菌群水平比較［，lg（N/g），n=51］Tab.5 Comparison of intestinal flora levels between the two groups［，lg（N/g），n=51］

注：與本組治療前比較，*P ＜0.05。Note：Compared with those before treatment，*P ＜0.05.

表6 兩組患者臨床療效比較［例（%），n=51］Tab.6 Comparison of clinical efficacy between the two groups［case（%），n=51］

表7 兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況比較［例（%），n=51］Tab.7 Comparison of incidence of adverse reactions between the two groups［case（%），n=51］

3 討論

目前，臨床治療T2DM以口服降糖藥物為主，如鹽酸二甲雙胍和阿卡波糖等，療效已得到證實(shí)，但同時(shí)也有不良反應(yīng)，故臨床仍需尋求新的增效減毒治療方案［8］。

iNKT 細(xì)胞屬特殊的T 淋巴細(xì)胞亞群，其可通過(guò)識(shí)別由CD1d 分子提呈的脂質(zhì)抗原，進(jìn)而被激活，活化的iNKT 細(xì)胞可分泌IL-4 和IFN-γ 等多種細(xì)胞因子，進(jìn)一步發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［9］。研究顯示，肥胖患者外周血中iNKT 細(xì)胞比例降低，其分泌的抗炎因子水平也隨之下降［10］。LYNCH 等［11］的研究表明，缺乏iNKT 細(xì)胞的模型小鼠通過(guò)高脂喂養(yǎng)后出現(xiàn)促炎因子水平升高而抑炎因子水平降低、體質(zhì)量增加、FBG 顯著升高等糖耐量受損現(xiàn)象，直接輸注iNKT 細(xì)胞后，可改善模型小鼠iNKT細(xì)胞增殖活躍、體質(zhì)量減輕等情況，提示iNKT 細(xì)胞與T2DM的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

T2DM 也是一種由細(xì)胞因子介導(dǎo)的慢性炎性疾病，IL-6 和hs-CRP 等炎性因子水平的升高可能是T2DM進(jìn)展的危險(xiǎn)因素［12］。IL-6 是由活化的T細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子，其可促進(jìn)B 細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量IgG 抗體，進(jìn)而使殺傷性T 細(xì)胞的過(guò)度活化，引起胰島B 細(xì)胞死亡，導(dǎo)致胰島素分泌不足。hs-CRP 是當(dāng)機(jī)體受到刺激或損傷時(shí)由肝臟合成的一種急性期蛋白，是機(jī)體炎性反應(yīng)的靈敏性指標(biāo)。當(dāng)各種刺激導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌增多時(shí)，肝臟可促進(jìn)合成hs-CRP，從而抑制胰島素受體活性、加重胰島素抵抗；而胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致胰島素敏感性下降，減弱對(duì)肝臟合成hs-CRP 的抑制作用，進(jìn)一步促進(jìn)其分泌增加。研究已證實(shí)，DM 患者外周血中IL-6和hs-CRP水平顯著升高［13］。

LPS是革蘭陰性細(xì)菌代謝過(guò)程中的主要產(chǎn)物，被認(rèn)為是慢性炎癥的關(guān)鍵刺激因子［14］。T2DM 患者的LPS 水平顯著高于健康人群，經(jīng)治療后顯著降低［15-16］。

腸道菌群紊亂可引發(fā)組織的慢性炎癥及能量代謝紊亂等，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體胰島素抵抗等［17］，其與T2DM 發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。T2DM 患者腸道中存在有害菌群增多狀況，通過(guò)益生菌干預(yù)可顯著增加腸道有益菌含量，改善腸道菌群失調(diào)狀態(tài)［18-19］。鄭雪萍等［20］的研究顯示，益生菌聯(lián)合常規(guī)降糖治療可顯著改善DM 患者的糖代謝指標(biāo)，并提高原有治療方案的臨床療效。SUN 等［21］的研究表明，使用益生菌聯(lián)合降血糖藥治療后患者的炎性因子水平顯著降低，說(shuō)明益生菌具有調(diào)節(jié)免疫及減輕炎性反應(yīng)作用。本研究結(jié)果顯示，益生菌干預(yù)后患者的臨床療效、iNKT 細(xì)胞比例、IL-4+iNKT 比例顯著升高，雙歧桿菌及乳桿菌數(shù)量顯著增加，其IFN-γ+iNKT 比例和FBG，HbA1C，2 hPG，hs-CRP，IL-6，LPS 水平均顯著降低，腸球菌和球桿菌數(shù)量均顯著減少，說(shuō)明益生菌干預(yù)可改善T2DM 患者的免疫內(nèi)環(huán)境、糖代謝、腸道菌群失調(diào)狀況，并減輕機(jī)體的炎性反應(yīng)。此外，兩組患者的不良反應(yīng)發(fā)生率相當(dāng)，表明益生菌干預(yù)不會(huì)增加藥品不良反應(yīng)。

綜上所述，益生菌干預(yù)可改善T2DM 患者的iNKT細(xì)胞水平、降低血糖和炎性因子水平，并改善腸道菌群失調(diào)狀態(tài)。