西帕依固齦液成分鑒定及其治療復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

馬 璇，范晨陽(yáng)，季志紅，李柯翱，聶繼紅

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新奇康藥業(yè)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000）

復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍（RAU）為臨床常見(jiàn)口腔黏膜疾病，常反復(fù)發(fā)作，病因尚不明確，主要與遺傳及免疫、細(xì)菌因素、微量元素缺乏及食物抗原、精神因素、機(jī)械損傷、系統(tǒng)疾病及激素紊亂、氧化應(yīng)激等有關(guān)［1-2］。目前多采用局部治療與全身治療相結(jié)合，以達(dá)到縮短潰瘍發(fā)作期、延長(zhǎng)間歇期、減輕疼痛和減少潰瘍數(shù)量的目的［3］。西帕依固齦液以沒(méi)食子為原料經(jīng)現(xiàn)代工藝制成，收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》［4］，有健齒固齦、清血止痛等功效，用于治療口腔疾病。臨床研究表明，西帕依固齦液可明顯減少?gòu)?fù)發(fā)性口腔潰瘍數(shù)，縮小潰瘍直徑，對(duì)口腔黏膜無(wú)刺激性［5-6］。本研究中通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段分析西帕依固齦液中化合物可能的作用靶點(diǎn)及作用途徑，預(yù)測(cè)其治療RAU的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 化學(xué)成分鑒定

1.1 儀器與試藥

儀器：H-Class 型超高效液相色譜儀及XEVO-G2XS QTOF型質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）。

試藥：西帕依固齦液（新奇康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為20190905）。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min時(shí)1%B，1～5 min時(shí)10%B，5～50 min時(shí)25%B，50～80 min時(shí)30%B，80～90 min 時(shí)50%B，90～100 min 時(shí)90%B）；流速為0.8 mL/min。

質(zhì)譜條件：負(fù)電離（ES-）掃描模式，毛細(xì)管電壓2.5 kV；樣品錐孔電壓40.0 kV，源溫度100 ℃，去溶劑溫度250 ℃，錐孔氣流量50.0 L/h，去溶劑氣流600.0 L/h。

1.2.2 試驗(yàn)結(jié)果

采用液相色譜-質(zhì)譜法分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)過(guò)分子量比對(duì)，查閱文獻(xiàn)［7-8］，鑒定出8 種化學(xué)成分，詳見(jiàn)表1。

表1 西帕依固齦液化學(xué)成分鑒定結(jié)果Tab.1 Identification of chemical components in Xipayi Mouth Rinse Fluid

2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1 活性成分及靶點(diǎn)收集

文獻(xiàn)挖掘西帕依固齦液中8個(gè)化學(xué)成分，質(zhì)譜分析得11個(gè)化學(xué)成分，去重后共獲得914個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 RAU 疾病靶點(diǎn)收集

以“recurrent aphthous ulcer（stomatitis）”為關(guān)鍵詞在DisGeNET，Human Phenothpe Ontology 和DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜集，分別獲得RAU基因27，11，117個(gè)；從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（系列：GSE37265）獲得RAS的差異表達(dá)基因，利用RStudio進(jìn)行分析，共獲得差異表達(dá)基因80個(gè)，前20個(gè)見(jiàn)圖2（紅色代表基因上調(diào)，黑色代表未發(fā)生差異表達(dá)，綠色代表基因下調(diào)）。獲得的差異表達(dá)基因作為RAU 的相關(guān)靶點(diǎn)，與DisGeNET、Human Phenothpe Ontology和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的靶點(diǎn)取交集，共獲得206個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.3 復(fù)方靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、基因本體論（GO）富集及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析

將西帕依固齦液活性成分914 個(gè)靶點(diǎn)與RAU 疾病206 個(gè)靶點(diǎn)取交集，獲得33 個(gè)靶點(diǎn)。反向?qū)ふ遥@得5 個(gè)對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分（見(jiàn)表2），導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建復(fù)方靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見(jiàn)圖3（綠色代表活性成分，紅色代表基因）。

表2 西帕依固齦液治療RAU靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)化學(xué)成分Tab.2 Chemical components corresponding to the target of Xipayi Mouth Rinse Fluid in the treatment of RAU

對(duì)33 個(gè)基因進(jìn)行GO 富集分析，共獲得920 項(xiàng)，其中生物過(guò)程（BP）877 項(xiàng)，細(xì)胞成分（CC）10 項(xiàng)，分子功能（MF）33 項(xiàng)（P＜0.01），P值較小的前10 項(xiàng)富集結(jié)果見(jiàn)圖4。前3個(gè)生物過(guò)程為對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控，前3 大細(xì)胞組成為膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)，前3 項(xiàng)分子功能為細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性。

對(duì)33個(gè)潛在基因進(jìn)行KEGG通路分析，共獲得12條通路（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)圖5。前4條信號(hào)通路為NF-κB信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、程序性壞死、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用。

3 討論

本研究中利用液相色譜/質(zhì)譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)構(gòu)建了西帕依固齦液治療RAU 的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，西帕依固齦液中5個(gè)化學(xué)成分對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)均有影響，如沒(méi)食子酸、鞣花酸和棕櫚酸分別作用于FAS 和CYP2E1靶點(diǎn)。沒(méi)食子酸類物質(zhì)具有抗癌［9］、抑菌［10］、抗炎［11］、抗病毒［12］、促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］等多種藥理活性。鞣花酸清除自由基的能力很強(qiáng)，具有抗氧化［14］作用，還可通過(guò)影響NK細(xì)胞活性而起到一定的免疫調(diào)節(jié)作用［15］。

目前的研究認(rèn)為，RAU 的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（IL）、干擾素（IFN）、腫瘤壞死因子（TNF）以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）有關(guān)，包括IL-6，IL-10，IL-4，IL-18，IFN-γ，TNF-α，TGF-β 等［16-18］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，西帕依固齦液治療RAU 最相關(guān)的通路為NF-κB 信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路、程序性壞死與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，通路中涉及的抗炎、鎮(zhèn)痛相關(guān)靶點(diǎn)包括IL-6，TNF，F(xiàn)AS 等，與目前研究的RAU 主要靶點(diǎn)相一致。臨床研究表明，西帕依固齦液能降低慢性牙周炎患者齦溝液中的TNF-α，IL-6，IL-8 水平，升高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）水平［19］。西帕依固齦液能抑制模型大鼠牙齦炎牙齦組織中核因子（NF）-κB-p65 和環(huán)氧合酶（COX-2）的表達(dá)［20］；同時(shí)，西帕依固齦液可明顯抑制前列腺素E2（PGE2）的合成與分泌［21］。沒(méi)食子提取物可抑制口腔細(xì)菌生物膜中葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的（GTF）活性，發(fā)揮防齲作用［22］。

IL-6 是炎性疼痛的重要參與因子，可通過(guò)增加TNF-α，誘導(dǎo)產(chǎn)生前列腺素而引起疼痛反應(yīng)［15］。此外，RAS 的發(fā)生也有細(xì)菌因素，正常人群口腔內(nèi)細(xì)菌的種類主要由9個(gè)細(xì)菌門組成，RAU患者口腔菌群發(fā)生了改變［2，23］。酶促抗氧化系統(tǒng)在RAU 的發(fā)病機(jī)制中起了關(guān)鍵作用，RAU 患者血清中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、TNF-α、髓過(guò)氧化物酶（MPO）、總氧化狀態(tài)（TOS）水平和氧化應(yīng)激指數(shù)（OSI）升高，一氧化氮（NO）、IL-10和抗氧化狀態(tài)（TAS）水平降低［24-25］。

綜上所述，西帕依固齦液所含沒(méi)食子酸等核心成分能作用于TNF，IFN-γ 等基因，繼而調(diào)控NF-κB，HIF-1等多條信號(hào)通路，從而發(fā)揮治療RAU的作用。