茴拉西坦對局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠的神經保護作用*

柴 娟，張瀟瀟，李 丹，徐沙麗

（華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院神經內科，湖北 武漢 430077）

腦缺血再灌注（I/R）損傷是嚴重的健康問題［1］，其損傷機制復雜，其中炎性損害影響較大，可能成為潛在的治療靶點［2］。NLRP3 是重要的組織損傷傳感器，線粒體受損釋放線粒體DNA（mtDNA）和線粒體活性氧（mtROS）激活了NLRP3 炎性體［3］，NLRP3 直接與銜接子分子ASC 結合，后者隨后募集并激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前體（pro-caspase-1），促進NLRP3炎性小體的細胞質多蛋白復合物形成，該復合物能將前體白細胞介素1β（IL-1β）和前體白細胞介素18（IL-18）裂解成活性形式，啟動和放大炎性反應［4］。NLRP3炎性體活性的功能障礙與多種疾病有關，如阿爾茨海默病、2型糖尿病、動脈粥樣硬化和癌癥［5］，同時NLRP3炎性體的激活可促進腦I/R損傷的病理發展。激活轉錄因子4（ATF4）是主要的內質網應激（ERS）反應效應物，參與多種疾病的進程，其在細胞存活和死亡中的作用尚不完全清楚。嚴重或長期的ERS 后，PERK-elF2α-ATF4-CHOP 信號級聯反應的激活是ERS 誘導凋亡細胞死亡的原因［6］。研究表明，在帕金森癥細胞模型中，ATF4可抑制神經細胞的凋亡［7-8］。茴拉西坦具有神經保護作用，可保護模型大鼠和小鼠的大腦免受缺血性中風的侵襲［9］。茴拉西坦可縮小中風急性期缺血性腦梗死的面積，減少DNA片段化和線粒體細胞色素c釋放并抑制腦中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的活性。本研究中探討了茴拉西坦對局灶性腦I/ R 模型大鼠的神經保護作用及其作用機制，為腦I/ R 的治療提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：5-0 尼龍單絲（北京奇諾科技有限公司）；IMT-2 型倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；StepOne Plus 型熒光定量PCR 儀（美國AB 公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

試藥：茴拉西坦（批號為ED63652.36）、尼莫地平（批號為XS52963.36），均購自亞寶藥業集團股份有限公司；聚L-賴氨酸（美國Sigma 公司，批號為SX85954）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑（大連寶生物科技有限公司，批號為DF4569.36）；Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司，批號為SE56969.36）；PrimeScriptRT 試劑盒（德國Merck 公司，批號為514489）；iCycler IQ 多色檢測系統（美國Bio-Rad 公司）；蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液（美國Sigma-Aldrich 公司，批號為ER47636）；BCA 蛋白測定試劑盒（北京活力生物技術有限公司，批號為TY45858.36）；SDS-PAGE 凝膠（加拿大TakaraBioInc.，批號為6569748）；硝酸纖維素膜（美國Millipore公司，批號為WS152545.63）；小鼠單克隆抗人ATF4、NLRP3 一級（1∶1 000，1∶2 000，批號分別為ED4526.98，ER8597.54），小鼠單克隆抗人類GAPDH（1∶500 0，批號為XD41586.96），HRP 偶聯的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG（1∶5 000，批號為EC52564.74），均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；電發光ECL試劑盒（美國Cell Signaling Technology公司，批號為MN5254.67）。

動物：SD 大鼠100 只，SPF 級，雌雄各半，8～10 周齡，體質量280～300 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK（渝）2020-0003。大鼠飼養環境為溫度22～26 ℃，相對濕度40%～70%，人工黑暗和光照交替12 h/12 h。

1.2 實驗方法

模型復制與分組、給藥：將100 只SD 大鼠分為對照組（A 組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（B 組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、尼莫地平組（C組，50 mg/kg），以及茴拉西坦低、高劑量組（D1組、D2組，50，100 mg/kg）［10］，各20只。腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠，然后在腹中線頸部切口，向左暴露并結扎左頸總動脈和外頸動脈。將5-0 尼龍單絲的末端涂有聚L-賴氨酸的鈍頭插入頸內動脈，并向前進入大腦中動脈起源，直至遇到輕微阻力，局部腦血流量（CBF）較基線水平降低20%；閉塞1 h 后，緩慢抽出尼龍單絲實現再灌注，CBF為基線的75%表明局灶性腦I/ R 大鼠模型復制成功。建模成功后灌胃相應藥物或等體積0.9%氯化鈉溶液（每100 g體質量1 mL），每日1次，連續4周。

雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間、Longa 評分、腦梗死體積測定：進行貼紙去除及平衡木行走實驗［8-9］。采用Longa 評分評價腦神經功能。4 分，不能自發行走，意識喪失；3 分，身體向左側傾倒；2 分，自主運動時向左側劃圈；1分，不能伸展左側前爪；0分，無神經功能損傷癥狀。測定腦梗死體積，并計算腦梗死體積百分比（右側腦梗死面積× 切片厚度/ 右側腦組織總體積×100%）。

腦病理組織學改變觀察：取出腦組織，固定，脫水，包埋，切片，HE 染色，在顯微鏡下觀察大鼠腦組織病理形態學。

ATF4 和NLRP3 mRNA 表達水平測定：取凍存的大鼠腦組織樣本50 mg，采用Trizol 法提取 總RNA，鑒定完RNA 純度和完整性后，采用逆轉錄制備cDNA。PCR反應條件為，95 ℃預變性10 s；94 ℃變性15 s，40 個循環；55 ℃退火30 s；70 ℃延伸30 s終止反應。讀取循環閾值（Ct值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 的表達量。各組設3 個復孔，實驗重復3 次。由RiboBio（中國廣州）設計的ATF4，NLRP3引物。引物序列為ATF4，5'-GAAGCTCCTACGCCTTTG-3'，5'-TCCTCCCTTCAACATTCTG-3'；NLRP3，5'-AGGGTTCACAGTGGCTAAG-3'，5'-GAGAGGAGAGGAAGAGGGAA-3'；GAPDH，5'-TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3'，5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3'。

ATF4 和NLRP3 蛋白表達水平測定：取凍存的大鼠腦組織樣本50 mg，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液，以BCA 法測定蛋白含量。各組取20 μg，上樣，10% SDS-PAGE 電泳后電轉。用含0.1%Tween-20 Tris緩沖液的5%脫脂奶粉封閉2 h；加入1抗，4 ℃孵育過夜；加入HRP偶聯的山羊抗小鼠IgG，室溫振搖1 h；加入ECL 化學發光試劑，將PVDF 膜放入暗盒中，壓上X 膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗；然后以Quantity One 軟件將條帶灰度值數字化，以目的條帶（ATF4，NLRP3）與內參條帶（GAPDH）灰度比值為各目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間、Longa 評分、腦梗死體積

與A 組比較，B 組大鼠雙側貼紙去除時間和平衡木過桿時間均顯著延長，腦梗死體積增大，Longa 評分顯著升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組和D2組大鼠雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間均顯著縮短，腦梗死體積顯著縮小，Longa 評分顯著降低（P ＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間、Longa評分、腦梗死體積比較（，n=20）Tab.1 Comparison of bilateral sticker removal time，balance beam passing time，Longa score and cerebral infarction volume of rats in each group（，n=20）

表1 各組大鼠雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間、Longa評分、腦梗死體積比較（，n=20）Tab.1 Comparison of bilateral sticker removal time，balance beam passing time，Longa score and cerebral infarction volume of rats in each group（，n=20）

注：與A組比較，*P ＜0.05；與B組比較，#P ＜0.05。表2同。Note：Compared with those in group A，*P ＜0.05（for Tab.1 and Tab.2）；Compared with those in group B，*P ＜ 0.05（for Tab.1 and Tab.2）.

2.2 腦組織病理形態學

A 組大鼠腦組織結構正常，神經細胞均勻分布，無異常；B 組大鼠腦組織出現空泡壞死灶，神經細胞體積變大（壞死），分布紊亂，可見顯著炎性細胞浸潤；C 組、D1組和D2組大鼠的腦組織結構均趨于正常，神經細胞壞死顯著減少。詳見圖1。

2.3 腦組織ATF4 和NLRP3 mRNA 表達水平

與A組比較，B組大鼠腦組織ATF4 mRNA表達水平顯著降低，NLRP3 mRNA表達水平顯著升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組和D2組大鼠腦組織ATF4 mRNA表達水平均顯著升高、NLRP3 mRNA 表達水平顯著降低（P ＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠腦組織ATF4和NLRP3 mRNA及蛋白表達水平比較（，n=20）Tab.2 Comparison of ATF4 and NLRP3 mRNA and protein expression levels in brain tissue of rats in each group（，n=20）

表2 各組大鼠腦組織ATF4和NLRP3 mRNA及蛋白表達水平比較（，n=20）Tab.2 Comparison of ATF4 and NLRP3 mRNA and protein expression levels in brain tissue of rats in each group（，n=20）

2.4 腦組織ATF4 和NLRP3 蛋白表達水平

與A 組比較，B 組大鼠腦組織ATF4 蛋白表達水平顯著降低，NLRP3 蛋白表達水平顯著升高（P ＜0.05）；與B組比較，C組、D1組和D2組大鼠腦組織ATF4 蛋白表達水平均顯著升高，NLRP3蛋白表達水平顯著降低（P ＜0.05）。詳見表3。

3 討論

本研究結果顯示，C 組、D1組和D2組大鼠雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間均短于模型組，腦梗死體積小于B 組，Longa 評分低于B 組（P ＜0.05）。表明茴拉西坦能縮小局灶性腦I/ R 模型大鼠腦梗死體積，其高劑量效果與尼莫地平相似。尼莫地平為鈣拮抗劑，用于缺血性腦血管病、偏頭痛、輕度蛛網膜下腔出血所致腦血管痙攣的治療，是腦I/R 損傷的經典治療藥物［11］。茴拉西坦屬拉西坦類腦細胞代謝藥，能增強神經細胞突觸內磷脂酶活性，并增加腦內三磷酸腺苷（ATP）的形成和轉運，增加蛋白質和核糖核酸（RNA）的合成，促進大腦對氨基酸、磷脂、葡萄糖和氧的利用，增加機體反應性和興奮性［12］。口服茴拉西坦可顯著抑制硫代巴比妥酸反應性物質的生成，并減緩前腦I/ R 后大鼠腦中谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的流失［13］。本研究結果與上述研究結論一致。

茴拉西坦可降低大腦中動脈閉塞后大鼠的腦內細胞炎性反應和氧化損傷，對腦I/R 具有神經保護作用，其機制與減輕內質網應激介導的細胞凋亡有關［14］。本研究結果顯示，對照組大鼠腦組織結構正常，神經細胞均勻分布，無異常；模型組大鼠腦組織出現空泡壞死灶，神經細胞體積變大（壞死），分布紊亂，可見明顯炎性細胞浸潤；尼莫地平組及茴拉西坦低、高劑量組大鼠腦組織結構趨于正常，神經細胞壞死明顯減少。提示茴拉西坦能減輕灶性腦缺血再灌注大鼠腦神經炎性反應，與上述結論一致。

多項研究表明，活化的NLRP3 炎性小體及其相關細胞因子對腦I/ R 損傷有顯著影響［15］。使用siRNA 敲除NLRP3 可減輕腦I/ R 損傷［16］。ATF4 屬細胞保護因子，ATF4 上調在魚藤素介導的神經細胞死亡中具有保護作用；ATF4 誘導的sestrin 2 上調是保護一氧化碳誘導肝脂肪變性的原因。目前，ATF4對腦I/R損傷的作用及其潛在機制均未完全闡明。動物實驗結果表明，ATF4的過表達降低了腦I/R 損傷后IL-1β，IL-18，mtROS及活化的NLRP3 炎性小體水平［17］。可見，ATF4 可能通過抑制NLRP3炎性體的活化而在腦I/R 損傷中發揮神經保護作用。在短暫性腦缺血性損傷中，ATF4可能通過抑制核轉錄因子CHOP 而減輕內質網應激所致神經細胞凋亡［18］。本研究結果顯示，尼莫地平組及茴拉西坦低、高劑量組大鼠腦組織ATF4 mRNA 和蛋白的表達水平均高于模型組，NLRP3 mRNA 和蛋白表達水平低于模型組（P ＜0.05），表明茴拉西坦通過促進局灶性腦I/ R 模型大鼠腦組織ATF4 的表達而抑制NLRP3 的表達，與上述結論一致。

綜上所述，茴拉西坦對I/ R 模型大鼠具有一定神經保護作用，其機制與促進大鼠腦組織ATF4 表達、抑制NLRP3表達有關。