基于SSR標(biāo)記的胡麻粗脂肪及脂肪酸組分的關(guān)聯(lián)分析

高鳳云 斯欽巴特爾 周 宇 賈霄云 蘇少鋒 趙小慶 金曉蕾

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院特色作物研究所/內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，010031，內(nèi)蒙古呼和浩特）

胡麻（Linum usitatissimum L.）是特色油料作物，在我國(guó)主要分布于內(nèi)蒙古、甘肅、新疆、寧夏、河北和山西等地區(qū)[1-2]。胡麻籽富含不飽和脂肪酸（亞麻酸、亞油酸、油酸）、木酚素和亞麻膠等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有降血脂、降血壓、降血糖以及預(yù)防心腦血管疾病等多種保健功效[3-5]。

胡麻油脂含量的評(píng)價(jià)對(duì)胡麻品質(zhì)遺傳改良具有重要意義。趙利等[6]對(duì) 116份胡麻種質(zhì)資源的油脂和碘價(jià)含量進(jìn)行檢測(cè)分析，初步篩選出一批高亞麻酸的優(yōu)良種質(zhì)。伊六喜等[7]對(duì) 401份胡麻種質(zhì)進(jìn)行表型評(píng)價(jià)，篩選出亞麻酸含量55%以上的品種16份。張瓊等[8]以 162份胡麻重組自交系為研究材料，對(duì)粗脂肪和5種脂肪酸含量進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明，油脂含量存在廣泛變異，表現(xiàn)出超親分離現(xiàn)象。以上研究對(duì)胡麻油脂含量的評(píng)價(jià)具有一定意義，但表型數(shù)據(jù)易受環(huán)境影響，因此，有必要進(jìn)行基因型評(píng)價(jià)，并挖掘粗脂肪和脂肪酸組分含量關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵遺傳標(biāo)記。前人已廣泛用SSR標(biāo)記對(duì)胡麻遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)，Cloutier等[9]用30個(gè)EST-SSR引物對(duì)23份胡麻種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析。Wu等[10]采用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，在胡麻中開發(fā)出1574個(gè)SSR標(biāo)記。Choudhary等[11]利用22個(gè)SSR標(biāo)記的270個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與130份胡麻種質(zhì)的26個(gè)表型性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，獲得了 95個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。這些結(jié)果均說明利用SSR標(biāo)記對(duì)胡麻種質(zhì)遺傳多樣性評(píng)價(jià)及其關(guān)聯(lián)分析具有一定可行性。

本文以230份胡麻種質(zhì)為研究對(duì)象，通過品質(zhì)相關(guān)性狀的SSR標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析，獲得與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)，為胡麻分子標(biāo)記輔助選擇育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

試驗(yàn)于2018年在內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田（111°48′ E、40°49′ N）進(jìn)行，海拔 1056m，年降水量410mm，年日照時(shí)數(shù)3000h。以230份胡麻核心種質(zhì)材料為研究對(duì)象，其中112份為國(guó)內(nèi)種質(zhì)，分別來自6個(gè)胡麻主產(chǎn)區(qū)（內(nèi)蒙古23份、甘肅42份、河北14份、山西14份、寧夏12份、新疆7份），118份為國(guó)外種質(zhì)，分別來自9個(gè)國(guó)家（美國(guó)21份、荷蘭18份、匈牙利18份、加拿大16份、法國(guó)12份、巴基斯坦12份、阿根廷7份、伊朗7份、俄羅斯7份）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，種植3行，每行種200粒種子，行長(zhǎng)1.0m，行距30.0cm。按常規(guī)田間管理方法進(jìn)行管理。出苗后，苗期取 2.00g新鮮嫩葉片于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

待田間植株種子生理成熟后，從試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)取樣20株，用DA7200型近紅外儀分別測(cè)定棕櫚酸（palmatic acid，PAL）、硬脂酸（stearic acid，STE）、油酸（oleic acid，OLE）、亞油酸（linoleic acid，LIO）、亞麻酸（linolenic acid，LIN）和粗脂肪（crude fat，CF）等品質(zhì)性狀的含量。

1.4 基因組DNA提取、檢測(cè)及PCR擴(kuò)增

取出-80℃保存的樣品，用冷凍玻璃棒破碎，參照Stewart等[12]提出的CTAB法提取基因組DNA，用瓊脂糖凝膠和核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA的純度和濃度。從NCBI下載亞麻全基因組序列信息（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000224295.2）和亞麻EST-SSR信息，利用MISA和SSR IT軟件[13]檢測(cè)亞麻SSR引物信息。共得到81 369對(duì)SSR引物，利用Primer 5.0軟件默認(rèn)參數(shù)（堿基序列長(zhǎng)度120～300bp，Tm值 57℃～65℃，引物長(zhǎng)度 20～25bp）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，在設(shè)計(jì)結(jié)果中選擇150對(duì)SSR引物（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成），從中篩選出30對(duì)條帶清晰、重復(fù)性好的引物（表1），對(duì)供試材料進(jìn)行基因型檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為25.0μL（TaqMaster Mix：12.5μL、10μmol/L 引物共 1.0μL、40ng DNA模板3.0μL和超純水8.5μL）。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min，4℃保存。用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離產(chǎn)物，恒功率 70W 電泳1.5h，采用銀染法顯色[14]。通過DNA Marker1500，統(tǒng)計(jì)DNA差異條帶，標(biāo)記為“0”或“1”。

表1 30對(duì)引物序列Table 1 Sequences of 30 pairs of primers

1.5 數(shù)據(jù)處理

表型數(shù)據(jù)分析包括最大值、最小值、均值、方差、變異系數(shù)和遺傳多樣性分析。表型變異系數(shù)（CV）=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值。用Shannon Weaver指數(shù)衡量表型性狀的遺傳多樣性。用 SPSS 19.0軟件完成胡麻表型性狀之間的相關(guān)性分析和主成分分析[14]。

參照DNA標(biāo)準(zhǔn)物，記錄條帶大小和有無情況。在相同遷移位置上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，組成一個(gè)“1”和“0”的數(shù)據(jù)矩陣[15]。用 PopGene 1.32軟件計(jì)算有效等位基因數(shù)和引物多態(tài)性信息含量（PIC）[16]。用NTSYS 2.10軟件進(jìn)行遺傳相似性和非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類分析[17]。

用Structure 2.3軟件分析群體結(jié)構(gòu)，K值設(shè)置在 2～10，“Length of burn-in period”設(shè)置為 10 000，3次重復(fù)。根據(jù)K值得出折線圖，確定最佳K值[18-19]。

用TASSEL 5.0軟件對(duì)表型數(shù)據(jù)和SSR基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行廣義線性模型（general linear model，GLM）關(guān)聯(lián)分析，得出P值、表型變異解釋率、關(guān)聯(lián)位點(diǎn)以及表型效應(yīng)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡麻種質(zhì)品質(zhì)性狀分析

對(duì)230份胡麻種質(zhì)油脂含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（表2）表明，變異系數(shù)為7.39%～22.67%，遺傳多樣性指數(shù)為2.66～2.80，硬脂酸含量的變異系數(shù)最高，為22.67%，亞麻酸和粗脂肪含量的遺傳多樣性指數(shù)最大，均為2.80。根據(jù)變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)來判斷，230份胡麻種質(zhì)品質(zhì)性狀變異范圍較大，遺傳多樣性豐富，可用于優(yōu)異基因資源的挖掘研究。

2.2 胡麻種質(zhì)品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性分析

由表3可知，15對(duì)品質(zhì)性狀組合中有6對(duì)性狀間呈極顯著正相關(guān)，有3對(duì)性狀間呈極顯著負(fù)相關(guān)，粗脂肪含量與棕櫚酸、亞油酸和亞麻酸含量呈極顯著正相關(guān)，其中與亞麻酸含量的相關(guān)系數(shù)最大，為 0.669，說明高亞麻酸含量的品種粗脂肪含量也高。亞麻酸含量與棕櫚酸含量呈極顯著正相關(guān)（0.308），與油酸和亞油酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，該結(jié)果與前期對(duì)401份胡麻材料的表型分析結(jié)果一致[20]。亞油酸含量與硬脂酸含量呈極顯著正相關(guān)（0.394）。硬脂酸脫氫成為油酸，再脫氫成為亞油酸，因此硬脂酸含量越高亞油酸含量也越高。棕櫚酸含量與油酸含量呈極顯著正相關(guān)（0.360），與硬脂酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（0.429）。粗脂肪含量與其他4種脂肪酸含量均呈顯著正相關(guān)，說明不飽和脂肪酸含量與粗脂肪含量密切相關(guān)。

表3 胡麻種質(zhì)品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of quality characteristics of flax germplasms

2.3 SSR引物多態(tài)性分析

篩選出的30對(duì)SSR引物在230份胡麻材料中共擴(kuò)增出365個(gè)條帶（表4），平均每對(duì)引物擴(kuò)增出12.17個(gè)條帶，其中Lu291引物擴(kuò)增的條帶最多（18條），多態(tài)性位點(diǎn)在 6～18，有效等位基因數(shù)在1.2168～1.8320，引物 PIC 為 0.2489～0.6257，其中Lu37引物PIC最高，為0.6257，其次為L(zhǎng)u422引物，為0.6117，引物平均PIC為0.4322。圖2為24份亞麻種質(zhì)Lu840引物的擴(kuò)增結(jié)果。

圖2 引物L(fēng)u840在24份胡麻種質(zhì)中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of primer Lu840 in 24 flax germplasms

表4 30對(duì)SSR引物在230份胡麻種質(zhì)的擴(kuò)增結(jié)果Table 4 Amplification of 230 flax germplasms using 30 pairs of SSR primer

2.4 胡麻種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)分析

230份胡麻種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖 3）顯示，當(dāng)K=4時(shí)，ΔK出現(xiàn)顯著峰值，因此，K=4時(shí)，分為4個(gè)類群，第1類群和第3類群均為57份材料，第2類群為60份材料，第4類群為56份材料。從圖4看，4個(gè)類群的少數(shù)幾個(gè)材料摻雜其他顏色外，其他材料顏色基本一致，說明供試材料的部分種質(zhì)的遺傳背景較純。

圖3 ΔK隨K值的變化曲線Fig.3 ΔK with the change of K values

圖4 230份胡麻種質(zhì)群體結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Analysis of population structure of 230 flax germplasms

2.5 胡麻種質(zhì)品質(zhì)性狀與SSR多態(tài)性位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析

以Q值為協(xié)變量，用GLM進(jìn)行365個(gè)SSR多態(tài)性位點(diǎn)和表型數(shù)據(jù)之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析（表5），共發(fā)現(xiàn)26個(gè)SSR位點(diǎn)與胡麻脂肪酸和粗脂肪含量顯著關(guān)聯(lián)（P值≥5.00），其中檢測(cè)到的亞油酸含量SSR位點(diǎn)最多（8個(gè)），硬脂酸和棕櫚酸含量的SSR位點(diǎn)均是5個(gè)，粗脂肪含量SSR位點(diǎn)4個(gè)，亞麻酸含量SSR位點(diǎn)最少（1個(gè)）。表型變異解釋率在2.45%～3.44%（表5），S342位點(diǎn)對(duì)油酸含量表型解釋率最高（3.44%）。粗脂肪和亞油酸含量均有S116位點(diǎn)，亞油酸和亞麻酸含量均有S347位點(diǎn)，對(duì)這2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)一步驗(yàn)證后可以開發(fā)實(shí)用性分子標(biāo)記，為胡麻分子標(biāo)記輔助選擇育種中應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

表5 胡麻種質(zhì)品質(zhì)性狀與SSR多態(tài)性位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析Table 5 Association analysis of quality characteristic s and SSR polymorphism loci of flax germplasms

3 討論

胡麻是世界十大油料作物之一，我國(guó)內(nèi)蒙古因其特殊的自然環(huán)境，生產(chǎn)的胡麻籽粒飽滿，光澤度好，含油率高，獨(dú)具區(qū)域優(yōu)勢(shì)[3]。胡麻油脂含量及其遺傳多樣性評(píng)價(jià)是胡麻高值化育種的重要途徑之一。但由于胡麻脂肪酸含量屬多個(gè)基因控制的數(shù)量性狀，傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳學(xué)研究方法難以對(duì)數(shù)量性狀基因的效應(yīng)、作用方式以及染色體分布進(jìn)行準(zhǔn)確研究。分子育種實(shí)現(xiàn)了直接對(duì)目標(biāo)性狀基因型的選擇，大幅度提高了育種的選擇效率，縮短了育種年限。因而，品質(zhì)相關(guān)性狀緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記篩選研究對(duì)胡麻品質(zhì)遺傳改良具有重要意義。

粗脂肪和 5種脂肪酸組分含量的變異系數(shù)為7.39%～22.67%，遺傳多樣性指數(shù)為2.66～2.80，粗脂肪含量與亞麻酸、亞油酸、油酸和棕櫚酸含量呈顯著正相關(guān)，說明脂肪酸組分含量的提高可以增加粗脂肪含量，與前期研究[20]結(jié)果一致。此結(jié)果為胡麻育種親本選擇提供理論依據(jù)。為了更好地服務(wù)胡麻育種，這些試驗(yàn)結(jié)果還需要通過多年多點(diǎn)的大田試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定與評(píng)估。

近年來，胡麻 SSR標(biāo)記開發(fā)研究報(bào)道[21-22]較多，但這些開發(fā)的分子標(biāo)記應(yīng)用于胡麻分子育種的寥寥無幾，因此，胡麻種業(yè)發(fā)展需要更多種質(zhì)資源的表型和基因型鑒定評(píng)價(jià)，并挖掘?qū)嵱眯苑肿訕?biāo)記，加快育種進(jìn)程。作物大多數(shù)品質(zhì)性狀屬于數(shù)量性狀，被復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)控制，關(guān)聯(lián)分析可以鑒定某一群體內(nèi)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因間的關(guān)系，具有同時(shí)檢測(cè)同座位多個(gè)等位基因的能力，另外關(guān)聯(lián)分析還具有不需要專門構(gòu)建作圖群體、研究時(shí)間較少和精確性較高的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析方法發(fā)掘植物數(shù)量性狀基因已成為目前國(guó)際作物基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[23]。本研究利用30對(duì)SSR引物對(duì)230份胡麻核心種質(zhì)進(jìn)行基因型檢測(cè)，共擴(kuò)增出365個(gè)條帶，與6個(gè)品質(zhì)性狀的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，獲得了26個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)，其中S347位點(diǎn)與亞麻酸和亞油酸含量緊密關(guān)聯(lián)，S116位點(diǎn)與粗脂肪和硬脂酸含量緊密關(guān)聯(lián)。因此S347和S116標(biāo)記可以通過驗(yàn)證開發(fā)實(shí)用性標(biāo)記，在胡麻油脂遺傳改良中加以利用。

4 結(jié)論

230份胡麻種質(zhì)粗脂肪和5種脂肪酸組分含量的變異系數(shù)為 7.39%～22.67%，遺傳多樣性指數(shù)為2.66～2.80，說明供試材料遺傳多樣性豐富；篩選出了30對(duì)SSR引物，共擴(kuò)增出365個(gè)條帶，有效等位基因數(shù)在 1.2168～1.8320，引物 PIC 為 0.2489～0.6257；在群體結(jié)構(gòu)K=4時(shí)，可將230份胡麻資源材料分為4個(gè)類群；檢測(cè)到5種脂肪酸顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)22個(gè)，檢測(cè)到粗脂肪SSR位點(diǎn)4個(gè)。