施氮量對超級稻南粳9108產量、淀粉RVA譜特征值和理化特性的影響

李潤卿 申 勇 朱寬宇 王志琴 楊建昌

（江蘇省作物遺傳生理重點實驗室/江蘇省作物栽培生理重點實驗室/江蘇省糧食作物現代產業(yè)技術協同創(chuàng)新中心/揚州大學農學院，225009，江蘇揚州）

水稻是我國最主要的口糧作物，稻谷產量約占糧食產量的1/3，全國約有2/3人口以稻米為主食[1-2]。隨著城市化進程的加快，耕地面積逐漸減少，為保障我國糧食安全和人們生活水平，提高單位面積水稻產量迫在眉睫[3-4]。為了解決上述問題，我國開展了“超級稻”項目，經過我國審定的超級稻品種已達130多個[4-6]。與常規(guī)水稻品種相比，超級稻品種在相同施氮水平下可以增產12%～14%[7]。雖然選用超級稻品種可以大幅度提高水稻單產，但超級稻的高產離不開氮肥的大量投入，過量的氮肥投入不僅造成了氮肥利用率低，也會使稻米品質變差[8]。以往關于超級稻的研究大多集中在產量方面，在稻米品質層面，尤其對蒸煮食味品質和稻米淀粉理化性質的研究較少。

許多研究[9-12]表明，稻米蒸煮食味品質與其淀粉理化性質關系密切。淀粉中的直鏈淀粉含量、膠稠度以及糊化溫度是衡量稻米蒸煮食味品質的3個重要的理化指標，分別與米飯蒸煮后的柔軟性、硬度以及蒸煮時長密切相關[13]。施氮量對水稻稻米蒸煮食味品質有重要影響。有研究[14]認為，增施氮肥會使稻米的蒸煮食味品質變劣，也有研究[15]認為，適量施用氮肥可以改善稻米的蒸煮食味品質。上述結果不一致的主要原因可能在于稻米淀粉的理化特性，包括支鏈淀粉鏈長分布、熱力學特性、結晶度、有序和無序結構等指標對氮肥用量的響應差異所致[16-18]。目前關于超級稻品種的蒸煮食味品質與稻米淀粉結構和理化性質對施氮量的響應特點，以及淀粉結構和理化特性與蒸煮食味品質的關系還不清楚。本研究對此問題進行探討，為超級稻高產優(yōu)質品種的選育和栽培提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與材料

試驗于2020年在江蘇省揚州市江都區(qū)高徐鎮(zhèn)試驗田進行。試驗田前茬為小麥，土壤類型為沙壤土，地力中等偏上，土壤有機質 23.52g/kg、全氮1.50g/kg、堿解氮88.29mg/kg、速效磷34.71mg/kg和速效鉀87.92mg/kg。供試水稻品種為超級稻南粳9108。

1.2 試驗設計

參試品種于5月28日進行大田育秧，6月25日移栽，株行距為 25cm×15cm，雙本栽插，10月31日至11月4日進行收割計產。采用隨機區(qū)組設計，設置3個施氮量處理，即全生育期不施氮（N0）、施純氮 180kg/hm2（N180）和 360kg/hm2（N360），重復 3次。小區(qū)面積 30m2。施氮量（尿素折合純氮）分基肥、分蘗肥、促花肥和?；ǚ?次施用，施用比例為4:2:2:2。試驗田全部小區(qū)施過磷酸鈣（含P2O513%）300kg/hm2，于移栽前作基肥一次性施入；施氯化鉀（含K2O 60%）195kg/hm2，分基肥和拔節(jié)肥2次施用，施用比例為6:4。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 淀粉提取及直鏈淀粉含量測定 水稻收獲后進行脫粒，并將待測稻谷置于倉庫中儲存 3個月，待其理化特性穩(wěn)定后碾磨成精米，再將精米碾磨成米粉，稱取米粉20g于0.45%焦亞硫酸鈉水溶液中，并加入10mg/g堿性蛋白酶，室溫浸泡24h脫蛋白。將酶處理后的勻漿過200目篩，收集篩網上的殘留物。將殘留物與30mL去離子水混合，攪拌2min，然后再過200目篩。過濾后的淀粉漿以3000轉/min離心10min。去掉上清液，去除淺色的上層殘留物，剩余白色部分用20mL去離子水懸浮，再以3000轉/min離心10min。去除上清液，將上述離心步驟重復 5次，以確保雜質被完全去除。最后，淀粉在30°C的常壓下干燥，并用200目篩收集，將去蛋白的淀粉用于淀粉理化性質和結構相關指標[19-21]的測定，用耦合分光光度法[22]測定直鏈淀粉含量。

1.3.2 淀粉的結晶度（XRD） 取適量淀粉樣品，置于樣品臺上圓形凹槽內并均勻壓片，用RU200R型X射線粉末衍射儀（Rigaku，日本）測定淀粉的XRD圖譜。所使用的 X射線源是 Cu-K過濾輻射（λ=0.154nm）。X射線管電流和電壓分別設定為40mA和40kV。以0.2°/min的掃描速率掃描散射角（2θ），從 5°掃描至 40°。以先前的研究[23]結果為依據確定樣品結晶度公式：結晶度（crystallinity，%）=Ac/（Ac+Aa）×100，Ac是結晶峰的面積，Aa是非晶峰的面積。

1.3.3 淀粉的傅里葉紅外光譜分布（FTIR） 將50mg淀粉樣品加入1mL離心管，再加入100μL超純水，攪拌成面團膠稠狀，覆蓋在光譜儀上樣孔的表面。FTIR光譜使用Bruker Nexus 670光譜儀獲得，DTGS檢測器配備 ATR單反射池和鉆石晶體（458 入射角）（Nexus 670，Nicolet，Madison，WI，美國）。對于每次測量，在傅里葉變換之前，將64次分辨率為4-1的掃描加在一起。線形假設為洛倫茲線型，半寬為 19cm-1，分辨率增強因子為 1.9，經減水、基線校正和去卷積處理后，從光譜中提取1045、1022和995cm-1處的紅外吸收度值（cm-1為波數的單位，即1cm中所含波的個數）。

1.3.4 淀粉的黏滯性譜（RVA譜）特征 稱取3.00g淀粉樣品放入罐子，加25.00g蒸餾水，將罐子放入儀器，50℃保持1min，以12℃/min的速度上升至95℃，保持 2.5min，再以 12℃/min的速度下降至50℃，并保持2min。攪拌器的轉動速度在起始10s內為960轉/min，之后保持在160轉/min。用快速黏度分析儀（Model 3D，Newport Scientific，澳大利亞）測量相關指標，并用其配套軟件TCW（thermal cycle for windows）進行數據分析，對大米淀粉的黏度特性進行評價。

1.3.5 淀粉的熱力學特性 用差示掃描量熱儀DSC8500（PERKIN ELMER）對淀粉的熱力學特性進行研究。每個樣品（5mg，干重）裝入鋁鍋內（25/40mL，D=5mm），加入蒸餾水，獲得含水量為66.7%的淀粉―水懸浮液。樣品密封，在4℃下放置24h，然后在DSC中加熱。DSC分析儀以空鋁鍋為參照物進行校準。在 20℃～100℃范圍內，以10℃/min的速率加熱樣品盤，將淀粉樣品的熱轉變定義為起始溫度、糊化溫度（峰值溫度）、終止溫度、糊化焓和回生焓。焓以淀粉干重為基礎計算[22]。

1.3.6 淀粉的膨脹度與溶解度 稱取35mg（m0）淀粉樣品放于已知質量的離心管（m1）中，加入超純水，經震蕩、水浴加熱和離心后，棄去上清，稱重（m2），烘干后稱取總質量（m3），附著在離心管上的膠體為其吸水膨脹的質量，通過以下公式計算：溶解的質量（m4，g）=m0-（m3-m1）；溶解度（%）=m4/m1×100；膨脹度（g/g）=（m2-m1）/（m3-m1）。

1.3.7 熒光團輔助標記碳水化合物電泳法（FACE）分析支鏈淀粉的鏈長分布 參考Wu等[24]方法并做了一些修改以制備線性葡聚糖樣品和標記。稱取支鏈淀粉脫分支0.2～0.3mg的干燥線性葡聚糖樣品于2mL微量離心管中。4000轉/min離心2min（將粉末壓到試管底部），然后添加 1.5μL濃度為0.2mol/L 8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽（APTS）―15%冰醋酸溶液（將APTS粉溶解在15%冰醋酸中以獲得0.2mol/L的APTS溶液）。將混合物用旋渦混勻器混勻并在黑暗中以40℃孵育20h或60℃孵育90min，用以標記支鏈淀粉脫分支樣品[25]。之后加入80μL水并用旋渦混勻器混勻，直到所有沉淀溶解。將混合物經4000轉/min離心2min，然后將50μL上清液轉移至200μL微量離心管中，立即進行熒光團輔助標記的碳水化合物電泳。用FACE分析標記的線性葡聚糖（如上所述制備）的尺寸分布，得到鏈長分布（CLD）并表示為Nde(X)（下標“de”表示通過脫支淀粉獲得線性葡聚糖；X=DP，DP表示聚合度）。在PA-800 Plus系統上進行標記線性葡聚糖的分離，使用固態(tài)激光誘導熒光（LIF）檢測器進行監(jiān)測，并以氬離子激光作為激發(fā)源（Beckman-Coulter，Brea，CA，美國）。

1.3.8 產量及其構成因素 成熟期各個小區(qū)按照平均穗數取20穴用于考察單位面積穗數、穗粒數、結實率和千粒重。同時每小區(qū)取5穴水稻植株，按穗、莖、葉分開，烘箱烘干至恒重，用凱氏定氮儀Foss 8400測定氮含量，計算氮肥利用率指標。在收獲前1d每個小區(qū)收割5m2，脫粒測產。

1.4 數據處理

用Microsoft Excel 2013和SPSS 19.0軟件進行數據處理與統計分析。氮肥利用率指標的計算參照Xue等[26]的方法。

2 結果與分析

2.1 不同施氮量對產量及其構成因素的影響

由表1可得，與N0處理相比，N180處理下南粳9108產量增幅為46.33%，穗粒數增加29.31%，穗數增幅為23.61%；N360處理穗粒數增加36.21%，穗數增幅為 35.62%。N360處理下南粳9108的產量、穗數及穗粒數均最高。3個氮肥處理相比，N0處理下南粳9108的結實率最高，N360處理下結實率最低，且各處理差異顯著。與N180處理相比，N360處理下的千粒重有所降低但無顯著差異。

表1 不同施氮量條件下南粳9108產量及其構成因素Table 1 Yield and its components of Nanjing 9108 under different nitrogen application rates

2.2 不同施氮量對南粳9108氮肥利用率的影響

由表2可得，在3個施氮水平下，南粳9108的氮肥農學利用率和氮肥偏生產力在N180處理下最高，氮素產谷利用率及收獲指數在N0處理下最高。3個氮肥處理相比，南粳9108總吸氮量在N360處理下最大，N180處理總吸氮量比 N0處理增加71.37%，N360處理的總吸氮量比 N180處理增加20.12%，氮肥農學利用率、氮肥偏生產力、氮素產谷利用率和氮素收獲指數總體呈降低趨勢。

表2 不同施氮量條件下南粳9108的吸氮量及氮肥利用率Table 2 Nitrogen uptake and nitrogen use efficiency of Nanjing 9108 under different nitrogen application rates

2.3 不同施氮量對南粳9108淀粉理化性質的影響

2.3.1 蛋白質、直鏈淀粉含量及膠稠度 由表3可得，3個氮肥處理相比，N360處理下蛋白質含量最高，且各處理間差異顯著；N360處理下直鏈淀粉含量最低，與N180處理相比無顯著差異；N180處理下南粳9108的膠稠度最大，N0和N360處理下膠稠度均較N180處理顯著降低。

表3 不同施氮量條件下南粳9108的蛋白質、直鏈淀粉含量和膠稠度Table 3 Protein content, amylose content and gel consistency of Nanjing 9108 under different nitrogen application rates

2.3.2 淀粉RVA譜特征值 由表4可知，在3個氮肥水平下，南粳 9108的峰值黏度、熱漿黏度、崩解值及糊化溫度均隨施氮量的增加呈先升后降的趨勢，N180處理下的峰值黏度、熱漿黏度和崩解值最大，消減值最低。N360處理下的峰值黏度、熱漿黏度和崩解值最低，消減值最高。

表4 不同施氮量下南粳9108籽粒淀粉RVA譜特征值Table 4 RVA profile characteristics of starch of Nanjing 9108 grains under different nitrogen application rates

2.3.3 淀粉的結晶度和傅里葉紅外光譜（IR）值由表5可得，南粳9108的淀粉結晶度表現為N360＞N0＞N180。在淀粉的IR值中，1045/1022cm-1表示淀粉顆粒外部區(qū)域的有序結構含量，1022/995cm-1表示淀粉顆粒外部區(qū)域的無定形結構含量。南粳9108的1045/1022cm-1表現為N360＞N0＞N180，1022/995cm-1表現為N180＞N0＞N360。

表5 不同施氮量條件下南粳9108淀粉的結晶度與傅里葉變換紅外光譜（IR）值Table 5 Crystallinity and IR values of Nanjing 9108 starch under different nitrogen application rates

2.3.4 淀粉的熱力學特性 由表6可得，在各氮素水平下，南粳 9108的起始溫度無顯著差異，峰值溫度和終止溫度均表現為先升后降趨勢。南粳9108在N180處理下糊化焓最低，N360處理下最高，各處理間差異顯著?；厣屎突厣染贜180處理下最高，說明施氮量為180kg/hm2時可以降低南粳9108糊化所需要的能量。

表6 不同施氮量下南粳9108淀粉熱力學特征值Table 6 Thermodynamic characteristic values of Nanjing 9108 starch under different nitrogen application rates

2.3.5 淀粉的溶解度與膨脹度 由表 7可得，與N0處理相比，南粳9108在N180處理下的淀粉溶解度和膨脹度均顯著提升，而在N360處理下的溶解度和膨脹度均顯著降低，這說明施氮量在180kg/hm2時可以使南粳9108的溶解度和膨脹度顯著提高，過量施氮會導致南粳 9108的溶解度和膨脹度降低。

表7 不同施氮量條件下南粳9108淀粉的溶解度和膨脹度Table 7 Solubility and expansion of Nanjing 9108 starch under different nitrogen application rates

2.3.6 支鏈淀粉脫分支的鏈長分布 支鏈淀粉脫分支后的鏈長可分為A鏈（DP6＜12，短鏈）、B1鏈（13＜DP＜24，中鏈）、B2鏈（25＜DP＜36，中長鏈）和B3鏈（DP＞37，長鏈）。由表8可得，南粳9108 A鏈和B1鏈分布比例表現為N180＞N0＞N360；在3個氮素水平下，B2鏈和B3鏈的分布比例具體表現為N360＞N0＞N180。

表8 不同施氮量條件下南粳9108支淀粉不同鏈長分布比例Table 8 Different chain length distribution ratio of Nanjing 9108 amylopectin under different nitrogen application rates %

2.3.7 淀粉理化性質和淀粉結構的相關性分析

由表9可得，南粳9108的結晶度和1045/1022cm-1值與糊化焓以及糊化溫度呈顯著或極顯著正相關，與崩解值、溶解度以及膨脹度呈顯著或極顯著負相關。1022/995cm-1值與消減值、糊化焓以及糊化溫度呈極顯著負相關，與崩解值以及膨脹度呈顯著或極顯著正相關。

表9 南粳9108籽粒淀粉晶體穩(wěn)定性與其理化性質的相關性分析Table 9 Correlation analysis between starch crystal stability and physicochemical properties of starch in Nanjing 9108 grains

由表10可得，南粳9108的支鏈淀粉脫分支A鏈和B1鏈含量與淀粉結晶度、1045/1022cm-1值、消減值、糊化溫度和糊化焓呈顯著或極顯著負相關，與1022/995cm-1值、崩解值、溶解度和膨脹度呈顯著或極顯著正相關。支鏈淀粉脫分支B2鏈和B3鏈含量與淀粉結晶度、1045/1022cm-1值、糊化溫度和糊化焓呈顯著或極顯著正相關，與1022/995cm-1值、崩解值、溶解度和膨脹度呈顯著或極顯著負相關。

表10 南粳9108籽粒支鏈淀粉脫分支鏈長分布與淀粉理化性質的相關性分析Table 10 Correlation analysis between the distribution of amylopectin debranching chain length and the physicochemical properties of starch in Nanjing 9108 grains

3 討論

3.1 南粳9108產量對施氮量的響應特點

有研究[27-29]表明，水稻庫容的大小取決于水稻單位面積有效穗數或穗粒數，增加水稻的總穎花量是提高水稻單產的重要途徑之一。庫容大是超級稻品種高產的重要農藝特征，而氮肥量增加是提高單位面積庫容最快捷的措施[30]。有研究[31]表明，超級稻品種產量隨施氮量的增加而增加，特別是在高施氮量下產量潛力大，但關于超級稻產量隨施氮量的提高而增加是取決于穗粒數增幅對施氮量響應高，還是單位面積穗數增幅響應高，目前還不清楚。本研究觀察到，南粳9108產量在N180處理下顯著提高的主要原因在于穗粒數的大幅度提高，但在N360處理下穗粒數的增幅和單位面積穗數的增幅相近，以上結果表明，超級稻南粳9108的單位面積穗數和穗粒數的增幅因施氮水平而異，同時也表明高施氮量可以協同單位面積穗數和穗粒數提高。值得注意的是，增加施氮量雖然可以提高南粳9108的吸氮量，但其氮肥利用率指標逐漸降低，如氮肥偏生產力、氮肥農學利用率、籽粒氮素利用率以及氮素收獲指數；關于促進水稻對氮素吸收的同時提高水稻氮肥利用效率方面有待深入研究。

3.2 南粳 9108的 RVA譜特征值對施氮量的響應差異及其淀粉理化原因

RVA譜特征值與稻米蒸煮食味品質密切相關[32-33]，RVA譜特征值可以直接反映稻米口感及食味品質的優(yōu)劣、稻米蒸煮過程中升溫和降溫時米飯的糊化特性及黏滯性變化[25,34-36]，改善稻米RVA譜特征值對優(yōu)化食味品質及選育優(yōu)質稻米工作具有指導性意義[12]。本研究觀察到，南粳9108的崩解值、峰值黏度、熱漿黏度和糊化溫度均在N180處理下最高，消減值最低；在N360處理下則相反。上述結果表明，適量施氮（N180）可以使南粳9108稻米易于糊化，改善其蒸煮特性，使稻米蒸煮后不易回生，增加米飯適口性[12,36]，過量施氮則使南粳9108的蒸煮性和適口性變差。南粳9108在N180水平下RVA譜特征值較優(yōu)的原因可能是南粳9108在 N180水平下具有較高的溶解度、1022/995cm-1值、膨脹度及膠稠度，較低的結晶度、糊化焓和直鏈淀粉含量（與N360水平下無顯著差異）；并且相對結晶度和淀粉有序結構（1045/1022cm-1值）與糊化焓以及糊化溫度呈顯著或極顯著正相關，與崩解值、溶解度及膨脹度呈顯著或極顯著負相關，淀粉晶體無序結構（1022/995cm-1值）則相反。這些結果有助于N180處理下南粳9108稻米蒸煮時淀粉晶體穩(wěn)定性變差，利于糊化，同時也有利于米飯蒸煮冷卻后不易回生，米飯較軟，適口性較好[12,37]。

本研究進一步觀察到，N180處理下南粳9108支鏈淀粉A鏈和B1鏈含量占比增加，B3鏈含量占比降低，高施氮量（N360）則相反；相關性分析表明，支鏈淀粉A鏈和B1鏈含量占比與崩解值、溶解度、1022/995cm-1值和膨脹度呈現顯著或極顯著正相關，與消減值、結晶度、糊化溫度、1045/1022cm-1和糊化焓呈顯著或極顯著負相關，B3鏈含量與上述淀粉理化指標的相關性相反。有研究認為，支鏈淀粉短中鏈含量與稻米的蒸煮食味品質密切相關[36]，即支鏈淀粉短中鏈含量占比越多，稻米的蒸煮食味品質越好[38]。支鏈淀粉中較高的短中鏈含量可以提高稻米的蒸煮食味性的原因，根據本研究結果，推測支鏈淀粉中短中鏈含量高可以優(yōu)化RVA譜相關特征值，具體為支鏈淀粉短中鏈含量高可以增加淀粉晶體的無序結構（1022/995cm-1值）[39]，淀粉中的無序結構越多，結晶度就越小[13]，有利于淀粉溶解度和膨脹度的提高，使淀粉遇水快速析出，形成含水膠體，因此所需糊化淀粉的熱量變低（即熱焓值低）[40]，同時淀粉短中鏈含量越多，可以使熟米更加柔軟富有黏性，提高崩解值，降低消減值[41]，最終使稻米具有更好的蒸煮食味性。

3.3 關于超級稻品種產量、品質和氮肥利用效率的協同提高

在我國的水稻生產中，尤其對于超級稻品種，為確保其產量潛力的最大化，增加氮肥用量是最直接有效的方式[42]，但過量的氮肥投入不僅導致環(huán)境問題，致使氮肥利用率降低，也使水稻植株整體氮水平較高，特別是當水稻籽粒蛋白質含量較高時不利于淀粉顆粒的排列以及淀粉內在結構的塑造，導致稻米蒸煮食味性差等問題[42-44]。有研究[43-45]顯示，水稻的高產與優(yōu)質存在沖突，特別是高產與稻米蒸煮食味性之間的矛盾。如何協同提高水稻產量和稻米品質一直是水稻生產中的熱點問題[45]。稻米品質除受本身遺傳因素影響外，也受環(huán)境和栽培措施的影響，改進栽培措施是提高稻米品質的有效途徑[45]。近年來，“實地氮肥管理”[46-47]、“水分管理技術”[34,48]、“田間綜合管理”[49]以及“秸稈還田”[50-51]等栽培措施不僅可以減少氮肥的投入，協同提高產量和氮肥利用率，同時也能顯著改善稻米品質。在本試驗中，超級稻南粳9108在N180處理下蒸煮食味性最好，產量為9.16t/hm2，達到了水稻生產中的高產標準[52]，但是距離我國中、晚稻超級稻10.5t/hm2（700kg/畝）[53]以上的產量標準還存在一定的差距，雖然本試驗中N360處理下的產量表現已接近該標準，但稻米品質變劣，氮肥利用率降低。說明僅調節(jié)施氮量這一栽培措施難以實現水稻產量、品質和氮肥利用效率的協同提高，今后需要深入研究水稻高產、優(yōu)質、氮肥高效利用的綜合栽培技術。

4 結論

在施氮量0、180和360kg/hm2處理下，超級稻品種南粳9108的產量逐漸增加，各處理間差異顯著，氮肥利用率則逐漸降低。與不施氮相比，施氮量180kg/hm2時可改善南粳9108的蒸煮食味品質，高施氮量（N360）則會使其蒸煮食味品質變劣。在施氮量180kg/hm2條件下，支鏈淀粉短中鏈含量占比、崩解值、淀粉的無序結構、膠稠度、溶解度和膨脹度的提高，直鏈淀粉含量、糊化焓、結晶度和消減值的降低，是稻米蒸煮食味品質改善的重要原因。