C型產氣莢膜梭菌生產用菌種種子批的建立與鑒定

劉澤文，袁芳艷，劉 威，高 婷，周丹娜，楊克禮，郭 銳，李 暢，田永祥

（湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所/農業農村部畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室/畜禽病原微生物學湖北省重點實驗室，武漢 430064）

仔豬C 型產氣莢膜梭菌病又叫仔豬紅痢，是由C 型產氣莢膜梭菌引起的初生仔豬急性傳染病［1］，該病主要發生于3日齡以內的新生仔豬，主要臨床表現為排出淺紅或紅褐色稀糞，發病急劇，病程短促，發病率可達40%～50%，死亡率可高達100%。由于該病發病急、死亡快，疫苗免疫預防是防治該病的最好辦法之一。研究表明，將C 型產氣莢膜梭菌外毒素抗原經過脫毒、滅活，然后制成滅活疫苗，免疫昆明小鼠和家兔后，用產氣莢膜梭菌毒素對其進行攻毒，結果顯示滅活疫苗具有良好的免疫效果［2］。為研制仔豬C 型產氣莢膜梭菌病滅活疫苗，必須建立C 型產氣莢膜梭菌生產用菌種種子批。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 C 型產氣莢膜梭菌C59-2 第2 代基礎種子，定義為F0代，作為原始種子，由中國獸醫藥品監察所保存和供應。

1.1.2 培養基及試劑 普通肉湯、厭氣肉肝湯、肉肝胃酶消化湯、普通瓊脂斜面、石蕊牛乳、葡萄糖鮮血瓊脂、厭氧菌糖發酵管、生化試驗管及相關試劑，均購自青島海博生物技術有限公司。產氣莢膜梭菌A、B、C、D 定型血清，均由中國獸醫藥品監察所提供。C 型產氣莢膜梭菌凍干毒素（批號2007D），由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所制備、鑒定和保存。

1.1.3 試驗動物 16～20 g 昆明小鼠，購自湖北省實驗動物研究中心；懷孕69～74日母豬（C 型產氣莢膜梭菌毒素中和抗體陰性）10 頭，均來源于湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所試驗豬場。

1.2 基礎種子的制備及保存

將第2 代基礎種子（作為F0代菌種），分別接種改良厭氣肉肝湯小管，37 ℃靜置培養16～20 h，再移植500 mL 肉肝胃酶消化湯，36～37 ℃培養16～20 h，培養完成后，分別取樣進行純粹檢驗，3 000 r/min 離心30 min，收集沉淀加脫脂牛奶保護劑，混合均勻，定量分裝（1 mL/支）進行凍干，作為基礎種子1 代（記作F1）。同時，取離心上清測定毒素含量，連續傳代至第F13代，共制備凍干菌種13 代，凍干菌種置于2～8 ℃保存。

1.3 種子批的鑒定

種子批建立后，分別取F1、F5、F10、F13代基礎種子進行了鑒定。

1.3.1 純粹檢驗 凍干菌種用普通肉湯復溶，分別接種普通瓊脂斜面、普通肉湯、厭氣肉肝湯、石蕊牛乳各2 管，每管0.2 mL，培養48 h，判定結果。

1.3.2 形態、染色特性 取24 h 厭氣肉肝湯培養物，進行革蘭氏染色，觀察染色特性和菌體形態。

1.3.3 培養特性鑒定 取厭氣肉肝湯培養物，劃線接種葡萄糖鮮血瓊脂，厭氧培養24 h，觀察菌落形態和溶血特性。

1.3.4 生化特性鑒定 取厭氣肉肝湯培養物，移植1 次，分別接種厭氧菌生化培養管，每管0.2 mL，37 ℃培養7 d，觀察結果。

1.3.5 產毒素能力的測定 取厭氣肉肝湯培養物按1%接種量接種肉肝胃酶消化湯，35～36 ℃靜置培養16～20 h，離心后取上清液，用生理鹽水將毒素上清液進行不同倍數的濃度稀釋。取稀釋好的毒素稀釋液分別尾靜脈注射16～20 g昆明小鼠，每個稀釋度注射2 只，200 μL/只，觀察24 h。根據小鼠的死亡情況計算上清液中含有的小鼠最小致死劑量（MLD/mL）。待測毒素含量（MLD/mL）=小鼠2/2 死亡的毒素最高稀釋倍數×5。

1.3.6 血清型鑒定 用產氣莢膜梭菌定型血清，以毒素抗毒素中和試驗進行血清型定型。根據毒力測定結果，將培養上清稀釋成50 MLD/mL，分別與A、B、C、D 定型血清等量混合，37 ℃作用30 min，靜脈注射小鼠，觀察24 h，同時設注射2 MLD 毒素的小鼠作為對照。

1.3.7 免疫原性鑒定 將F1、F5、F10、F13代菌種按1%接種量分別接種肉肝胃酶消化湯，35～36 ℃靜置培養16～20 h 后，取樣進行純粹檢驗，并離心取上清測定毒素含量，同時加入終濃度為0.4%甲醛溶液，37 ℃滅活脫毒。取滅活脫毒菌液與20%氫氧化鋁膠按5∶1 混合，制成疫苗（以脫毒前計算毒素含量，為2 000 MLD/mL）。經檢驗合格后，免疫懷孕母豬2頭，于產前40～45日和15～20日各免疫1 次，每頭肌肉注射疫苗2 mL/次，同時設未免疫母豬2 頭作為對照。用免疫母豬所產1日齡仔豬5 頭，連同對照母豬所產1日齡仔豬5 頭，各耳靜脈注射最小致死劑量的C 型產氣莢膜梭菌毒素（35 MLD），連續觀察14日，對照仔豬應全部死亡，免疫母豬所產仔豬應不低于4 頭保護。

2 結果與分析

2.1 純粹檢驗和形態觀察

各代菌種均在厭氣肉肝湯中生長較快，37 ℃培養16～20 h 后，呈均勻渾濁并大量產氣，在石蕊牛乳中呈爆性發酵，普通肉湯中能生長，普通瓊脂斜面上不能生長。革蘭氏染色為陽性大桿菌，菌體兩端鈍圓，有莢膜，表明菌種純粹，菌體形態及染色特性符合C 型產氣莢膜梭菌特征。

2.2 培養特性

各代菌種在葡萄糖鮮血瓊脂上培養24 h，形成灰白色，半透明表面光滑、邊緣整齊的圓形菌落，菌落直徑1～2 mm，菌落周圍形成α、β 雙環溶血圈。

2.3 生化特性鑒定

取F1、F5、F10、F13代菌種進行生化特性鑒定，各代次菌株均能發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖、半乳糖，不發酵甘露醇、鼠李糖，靛基質、M-R 和V-P 試驗呈陰性，生化特性均符合C 型產氣莢膜梭菌特性［3］，具體結果見表1。

表1 菌種生化特性鑒定結果

2.4 產毒素能力的測定

對F1、F5、F10、F13代菌種的產毒系能力進行鑒定，結果各代次肉肝胃酶消化湯37 ℃培養16～20 h培養后菌液離心取上清液，各代次所產毒素含量分別為667、1 000、800 和800 MLD/mL，結果見2。

表2 菌種產毒素能力測定結果

2.5 血清型鑒定

取F1、F5、F10、F13代菌種肉肝胃酶消化湯培養物離心上清液，利用產氣莢膜梭菌定型血清進行中和試驗，確定菌株的血清型，結果各代菌種的培養上清均可被B、C 定型血清中和，而不被A、D 型血清中和，表明菌種的血清型為C 型，未發生變化，符合該菌株的血清型特性。

2.6 免疫原性鑒定結果

用F1、F5、F10、F13代菌種所制備的疫苗免疫母豬后，對其所產1日齡仔豬攻毒，對照母豬所產仔豬全部死亡，免疫母豬所產仔豬攻毒保護率均不低于4/5，結果見表3，表明各代種子批菌種的免疫原性均良好。

表3 菌種免疫原性鑒定結果

3 結論與討論

產氣莢膜梭菌是一類革蘭氏陽性、嚴格厭氧，有芽孢的桿菌，可以引起多種動物，包括仔豬、雞、牛和家兔等動物發病［4-10］。仔豬紅痢主要是由C 型產氣莢膜梭菌引起，產氣莢膜梭菌產生的主要毒素包括α、β、ε 和ι 等，可以將產氣莢膜梭菌分為A 型、B 型、C 型、D 型和E 型產氣莢膜梭菌［4］。仔豬紅痢是由C型產氣莢膜梭菌引起的初生仔豬（3日齡以內）高度致死性腸毒血癥，已排除紅色糞便，小腸黏膜彌漫性出血和壞死為特征［11］。該病一旦發生，病程短、死亡率高，即使通過藥物治療有一定療效，病豬仍會由于腸道的嚴重損傷而死亡，因此該病的預防比治療顯得更為重要。將仔豬紅痢滅活疫苗［12］免疫妊娠母豬，是新生仔豬通過吮吸母乳而獲得被動免疫而產生保護力。

為研制仔豬大腸桿菌病、C 型產氣莢膜梭菌病二聯滅活疫苗，為仔豬紅痢的免疫預防提供產品支持，必須建立C 型產氣莢膜梭菌生產種子批。本研究將C 型產氣莢膜梭菌C59-2 經連續傳代建立了基礎種子批，選取其中的F1、F5、F10、F13代菌種進行鑒定，表明各代菌種均純粹，培養特性、生化特性、血清學特性均符合C 型產氣莢膜梭菌C59-2 菌株的特征；每代產毒素能力均在600～1 000 MLD/mL 之間，通過毒素濃縮，完全可以達到二聯疫苗的配苗要求，用F1、F5、F10、F13代菌種所制備的疫苗免疫懷孕母豬后，對其所產1日齡仔豬進行攻毒，對照母豬所產仔豬全部死亡，免疫母豬所產仔豬攻毒保護率均不低于4/5，表明各代種子批菌種的免疫原性均良好。因此，建立的種子批可用于仔豬大腸桿菌病、C 型產氣莢膜梭菌病二聯滅活疫苗的生產和檢驗，為保證疫苗的質量，將基礎種子批的代次確定為F1～F10。