連香樹花芽發育過程中的生理生化特性研究

段秋笛，楊 旭，趙 焱，盧麗晶，崔秀偉，梁宏偉，4

（1.三峽大學生物與制藥學院，湖北 宜昌 443002；2.山東省濟南市林業局，濟南 250000；3.山東省濟南農業科學院，濟南 250000；4.三峽區域植物遺傳與種質創新重點實驗室（三峽大學）/三峽大學生物技術研究中心，湖北 宜昌 443002）

連香樹（Cercidiphyllum japonicum）為溫帶落葉喬木，屬連香樹科連香樹屬。連香樹為第三紀孑遺植物，間斷分布在中國和日本等亞洲地區，對于研究第三紀植物區系起源以及中國與日本植物區系的關系有十分重要的科研價值［1］。連香樹雌雄異株，植株結實率低，幼苗脆弱，容易受外界環境危害，難以生存，因此，在野外環境中種群年齡結構不穩定，資源稀少，瀕臨滅絕，是中國的二級保護植物［2］。連香樹高大雄偉，葉形奇特似心形，春季新發嫩葉和秋季葉色彩絢麗，是具有高觀賞價值的園林綠化樹種［3］。

連香樹的研究受到國內外學者的廣泛關注。廖興利等［4］研究了連香樹對不同海拔梯度環境的適應能力。有外國學者研究發現連香樹的物種多樣性與海拔呈二次相關和負相關［5］。相關學者對連香樹群落功能多樣性的調查揭示了其功能多樣性可作為瀕危物種連香樹保護效率的一個指標［6］。黃雪梅等［7］發現連香樹葉片C、N、P 化學計量特征已呈現出一定的性別二態性，這可能與其物種瀕危有關。馬文寶等［8］調查了天然連香樹種群性比并比較其雌、雄株之間的形態、光合能力、水分和養分利用效率差異，發現連香樹種群性比顯著偏雌，且該特性明顯影響了連香樹的天然繁殖。陳香波［3］對連香樹野生群實地調查發現連香樹群體年齡結構不合理，種群更新不良、面臨退化的風險。皮琪［9］對連香樹的適應性和繁殖特性研究表明，野生連香樹呈零星分布且相距較遠加劇了物種瀕危程度。

現有相關研究表明，造成連香樹天然繁殖困難的原因主要是其資源稀少、雌雄異株、結實較少。花器官是被子植物特有的在繁殖過程中產生的生殖器官，花芽分化發育是高等植物個體發育的中心環節，也是植物從營養生長轉向生殖生長、繁衍后代的關鍵步驟［10］。植物的雌雄花芽發育是植物有性生殖過程的重要階段，其發育好壞直接影響植物的授粉、受精和坐果［11］。可溶性糖和可溶性蛋白質等營養物質對植物花芽發育分化有重要作用［12］，過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）是植物防止膜脂過氧化酶促防御體系中重要的保護酶［13］。同時POD、SOD 等酶的活性也是影響花芽發育分化的重要指標［14］，而丙二醛則與植株抗逆性有關［15］。

本研究通過測量并分析連香樹花芽發育過程中相關生理生化指標的變化和雌雄株之間生理生化指標差異，探究其在花芽發育過程中的生物學功能和意義，從而為連香樹的有性繁殖提供有效的理論依據，對保護好這一珍稀瀕危樹種、保護生物多樣性及連香樹的可持續開發利用具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為采集于神農架地區7月末、10月中旬、12月末、次年3月初及3月末不同時期的連香樹雌株和雄株的花芽，即分別對應連香樹花芽發育的分化發育初期、分化完成期、休眠期、春季快速發育期及開花期，依次標記性別及時期，分別為S1、S2、S3、S4、S5，于-70 ℃條件下保存備用。

1.2 方法

試驗于2020年7月至次年3月末進行，于野外采集連香樹雌、雄花芽并立即液氮速凍保存。開展生理生化指標分析時，取等量的不同月份、不同性別的連香樹花芽，分別置于預冷的研缽中，加入1 mL預冷pH 7.0 的0.05 mol/L PBS 緩沖液（0.05 mol/L 磷酸二氫鈉40 mL+0.05 mol/L 磷酸二氫鉀60 mL），在冰浴中充分研磨成勻漿。將勻漿液全部轉入離心管中，12 000 r/min離心15 min。取上清液分裝于1.5 mL帶蓋塑料離心管中，置于-20 ℃條件下保存備用。過氧化物酶活性采用愈創木酚法測定，超氧化物歧化酶活性采用氮藍四唑法測定，可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍G-250 法測定，可溶性糖含量采用蒽酮法測定，丙二醛含量測定采用2-硫代巴比妥酸（TBA）法［16，17］。

1.3 數據分析

使用分光光度計測定吸光度，利用Excel 2010、Origin 2018、SPSS Statistics 17.0 軟件對數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 連香樹花芽發育過程中過氧化物酶活性的變化

由圖1 可知，POD 活性在花芽發育過程中呈先上升再下降的趨勢，各階段差異顯著，變化幅度較大。雌、雄花芽從S1 時期到S4 時期POD 活性整體增高，雄性花芽在S4 時期達到最高，POD 活性為44.23 U/（g·min·FW），參與植物體內多個代謝過程。雌性花芽的POD 活性在S3、S4 時期沒有顯著差異，花芽處于休眠期，POD 含量達到最高。S4 到S5 時期溫度逐漸升高，雌、雄花芽代謝活動加強，POD 活性顯著下降。

圖1 連香樹花芽發育過程中POD 活性變化

由單因素方差分析可得，雄性花芽POD 活性顯著高于雌性花芽POD 活性。POD 能更好地保護花芽，有利于使繁殖水平處于較高水平，推測連香樹雄花芽的分化比雌花芽分化需要更多的POD。

2.2 連香樹花芽發育過程中超氧化物歧化酶活性的變化

由圖2 可知，SOD 的活性在花芽發育過程中變化幅度較小，總體呈先緩慢下降再緩慢升高的趨勢，含量均處于較高水平。其中，S3 時期雄性花芽和雌性花芽SOD 活性最低，雄性花芽SOD 活性僅為541.03 U/（g·h·FW），S3 時期花芽處于休眠狀態，此時花芽細胞代謝作用較弱，自由基產生較少，SOD 活性較低。S1 到S2 時期，雌性花芽SOD 活性升高，花芽此時處于分化時期，代謝能力較強。S4 到S5 時期雌、雄花芽SOD 活性均明顯上升，花芽度過休眠期，進入春季快速發育期和開花期，細胞代謝能力強，SOD 活性升高。

圖2 花芽發育過程中SOD 活性變化

由單因素方差分析可知，雌、雄花芽的SOD 活性在S1 到S4 時期均有顯著差異，在S5 時期沒有顯著差異，總體雌性花芽SOD 活性高于雄性花芽，推測雌性花芽代謝能力較強，連香樹雌花芽的分化比雄花芽分化需要更多的SOD。

2.3 連香樹花芽發育過程中可溶性蛋白質含量的變化

由圖3 可知，在連香樹雌、雄花芽形成過程中，可溶性蛋白質含量呈先輕微下降再上升再下降的變化過程。分化發育初期、分化完成期和休眠期花芽內可溶性蛋白質含量逐漸波動升高，雌、雄花芽中可溶性蛋白質含量在休眠期積累至最大值，分別為144.86、132.54 mg/g。表明該段時期連香樹花芽中可溶性蛋白質合成活躍并逐漸積累，到休眠期含量積累達最大值，花芽準備越冬；而春季快速發育期和開花期花芽內可溶性蛋白質含量急劇下降，說明高含量的蛋白質可能有利于花芽的分化與形成。

圖3 連香樹花芽發育過程中可溶性蛋白質含量的變化

由單因素方差分析可知，分化發育初期和分化完成期雌株和雄株間可溶性蛋白質含量無顯著性差異，而休眠期、春季快速發育期及開花期雌性花芽的可溶性蛋白質含量顯著高于雄性，這可能與雌株和雄株間對環境適應的差異以及連香樹天然繁殖困難的原因有關。

2.4 連香樹花芽發育過程中可溶性糖含量的變化

由圖4 可知，在連香樹雌、雄花芽的形成過程中，可溶性糖含量在分化過程中均呈先上升再下降的趨勢。連香樹花芽分化發育初期及快速完成期可溶性糖合成活躍并逐漸積累，S3 時期可溶性糖含量達到最大值，在雌、雄花芽中分別為17.82、21.19 mg/g，花芽進入休眠期；而從休眠期到春季快速發育期及開花期花芽內可溶性糖含量急劇下降，說明連香樹花芽在春季快速發育期和開花期可溶性糖的消耗量較大。

圖4 連香樹花芽發育過程中可溶性糖含量的變化

由單因素方差分析可知，分化發育初期及快速完成期連香樹雌株可溶性糖含量顯著高于雄株，而休眠期、春季快速發育期和開花期表明連香樹可溶性糖含量雌株卻顯著低于雄株，表明在連香樹春季快速發育期和開花期雌株可溶性糖的消耗高于雄株。

2.5 連香樹花芽發育過程中丙二醛含量的變化

由圖5 可知，連香樹雌、雄花芽發育過程中丙二醛含量呈先增加再減少的趨勢，雌性花芽丙二醛含量在S3 時期達到最大，為1.66 μmol/（g·FW），雄性花芽在S4 時期達到最大，為1.27 μmol/（g·FW），而在S5 時期雌、雄花芽丙二醛含量分別下降到1.40、0.93 μmol/（g·FW）。這可能是隨著時間進入冬季，連香樹花芽逐漸進入休眠期，丙二醛含量增加，進入3月，連香樹花芽發育完成并進入開花期，丙二醛含量下降。表明丙二醛含量的變化可能與連香樹的花芽分化過程的抗逆性有關。

圖5 連香樹花芽發育過程中丙二醛含量的變化

由單因素方差分析可知，同一時期，連香樹雌、雄花芽的丙二醛含量均有顯著性差異，且雌性花芽丙二醛含量顯著高于雄性花芽。出現這一現象的原因可能是在連香樹雌、雄花芽發育過程中出現性別偏移，表明連香樹雌、雄花芽在發育過程中對環境的抗逆性不同，推測連香樹雌花芽分化比雄花芽分化需要更多的丙二醛。

3 小結與討論

過氧化物酶與呼吸作用、光合作用等有關，其活性的不斷變化，反映其水解過氧化物的程度［18］。雄性花芽POD 活性要高于雌性花芽POD 活性，這與溫偉慶等［19］對銀杏花芽研究相符。陶應時等［20］研究發現，連香樹雌、雄個體的光合特性在生理和生態方面可能不同，雄性花芽的光合作用與呼吸作用可能強于雌性花芽。POD 被認為參與成花信號誘導因子乙烯的生物合成［21］，POD 活性高時，參與雌、雄花芽的分化相關代謝，有助于花芽分化，并且高活性的POD 能有效清除過氧化物，維持細胞內氧自由基平衡，避免連香樹花芽受到傷害［18］。

超氧化物歧化酶能夠清除植物體內因代謝或其他行為而產生的自由基和活性氧，是一種重要的抗氧化劑，可清除細胞內產生的O2-生成H2O2，保護暴露在氧氣中的細胞。雌性花芽SOD 活性高于雄性花芽SOD 活性，但是對于銀杏與栝樓的研究中雄株的SOD 和POD 活性高于雌株［19，22］。高活性的SOD可維持細胞內氧自由基水平，保護花芽免受活性氧的毒害作用，有利于花蕊原基的分化［14］。

可溶性蛋白質在植物的生命活動中發揮著供能、免疫、控制生長分化等功能［23］。蛋白質影響著細胞的生長、分裂和分化，決定著植物的生長發育［24］。本試驗中，連香樹花芽分化發育初期、分化完成期可溶性蛋白質合成活躍并逐漸積累，當其含量達到最高值后花芽休眠，準備越冬并進行春化作用，表明高含量的可溶性蛋白質有利于花芽分化。連香樹花芽在春季快速發育期及開花期可溶性蛋白質的消耗量大，表明可溶性蛋白質對細胞的分化與形成有重要作用。胡靜等［14］對西紅花花芽研究結果也驗證了此觀點。雌株花芽的可溶性蛋白質含量高于雄株，這可能與雌株和雄株對環境適應的差異有關。雌、雄異株植物種群性別間的偏倚可能直接影響種群的繁育［25］，這可能與造成連香樹天然繁殖困難的原因有關。

花芽內貯藏的營養物質可轉化為花芽發育生長所需要的養分和能量［26］。可溶性糖是植物生長發育及性別分化的主要營養基礎［27，28］。在本試驗中，可溶性糖在連香樹花芽中的含量呈先輕微下降再上升再下降的變化過程，表明在連香樹花芽分化發育初期及分化完成期可溶性糖消耗與合成基本持平，隨花芽的進一步發育，花芽中可溶性糖合成加快并逐漸積累，從而支持連香樹花芽在春季快速發育期及開花期可溶性糖的大量消耗。與胡靜等［14］對西紅花研究中得出的可溶性糖含量可能限制花芽形成的結論相同。

丙二醛可對直接影響細胞膜上的各結合酶的數目比例和活性強弱，加劇膜脂過氧化，通常過量的丙二醛會使代謝失去調節作用，細胞則會失去正常的調節功能，因而會對細胞產生巨大的傷害［15，29］。陳麗麗等［30］對5 種植物進行升溫處理發現，其葉片在升溫過程中丙二醛含量均有所降低。李玉舒等［31］研究表明低溫脅迫下木槿丙二醛含量上升。連香樹雌性花芽在分化階段丙二醛含量上升并在休眠期達到最高，其變化可能與溫度降低有關，此時正值寒冬，連香樹花芽受低溫脅迫，故丙二醛含量上升。之后，丙二醛含量下降，可能與溫度回升有關。

花芽分化是一個復雜的過程，分為形態分化和生理分化［31，32］。總體來看，連香樹雌性花芽的超氧化物歧化酶活性、可溶性蛋白質和丙二醛含量顯著高于雄性，表明連香樹雌、雄花芽分化過程中出現性別偏移，這可能與連香樹瀕危有關。研究連香樹雌、雄花芽分化過程中抗逆性指標的變化，可對連香樹花芽分化過程有更好的了解，對于指導瀕危物種的保護具有重要意義。

通過對連香樹生理生化指標的綜合分析，發現連香樹花芽分化過程中雄性花芽總體POD 活性要高于雌性花芽總體POD 活性。花芽分化過程中POD 活性的變化可能是連香樹花芽為了維持細胞中氧自由基濃度的平衡，保護花芽免受活性氧的毒害作用的一種響應。花芽發育過程中可溶性糖與可溶性蛋白質含量總是在花芽分化期前積累到最高值并在花芽分化期急劇下降，表明其含量可能與連香樹花芽的發育形成具有密切相關性。不同時期雌性花芽的可溶性蛋白質、丙二醛含量均高于雄性花芽，這可能與連香樹雌、雄花芽性別分化以及雌株和雄株間對環境適應的差異有關。