不同耐/感玉米自交系對高溫脅迫的響應及其恢復力

謝 藝，倪艷林，朱 航，朱葉青，張 艷，鄒華文，張丙林

（長江大學農學院，湖北 荊州 434023）

玉米是重要的糧食作物和飼料作物，其種植面積和總產量僅次于水稻和小麥。雖然玉米在整個生育期內需要較高的溫度，但超過3 d 最高氣溫≥35 ℃的持續高溫天氣，則會影響植株的生長和發育，造成高溫熱害。中國南方地區的夏玉米在幼苗生長期間易遭遇高溫天氣，造成發育異常而減產。隨著全球工業化發展和溫室氣體排放的加劇，季節性高溫發生的頻率預計在未來幾十年內會增加［1，2］。全球氣候變暖將對夏玉米的生產帶來很大的負面影響［3］。

如果植物生長發育過程中受到高溫脅迫，其器官生理生化以及分子反應過程等均會產生響應。光合作用是植物物質轉化和能量代謝的關鍵，遭遇高溫后，由于葉片葉綠素含量減少，類囊體上的光化學反應和葉綠體基質上的碳代謝受到影響，從而造成玉米葉片光合作用能力下降，有機物合成量減少［4，5］。高溫脅迫導致植株葉片光合速率下降與其氣孔狀態有很大的關系，另外，葉片的蒸騰速率隨著氣孔的開閉而變化，受到高溫脅迫時，植株為防止葉溫過高而加快蒸騰來減少熱損傷。氣孔狀態也是影響植株葉片水分利用率的重要因素，有學者通過研究小麥葉片的氣孔發現，氣孔面積和氣孔孔徑寬度對水分利用率的影響很大［6］。

氣孔是植物碳同化、呼吸和蒸騰作用等氣體代謝的通路，在生理上具有重要意義［7］。植物通過改變氣孔的開度、大小、氣孔頻度（密度和指數）和氣孔與表皮細胞的分布狀態來適應各種生理逆境［8-11］。目前，關于高溫脅迫對氣孔的影響的研究相對較少，且結果不一致，一般認為高溫對植物葉片的氣孔性狀沒有影響［12-15］，但也有研究認為高溫可以改變氣孔狀態，比如氣孔密度、氣孔孔徑寬度和氣孔導度等。植物葉片的氣孔密度與其氣體交換過程密切相關，Song 等［16］、張立榮等［17］做了關于擬南芥和不同蒿類矮生草甸的研究，發現這些植物氣孔密度隨著溫度的升高而降低；朱玉等［18］對藍莓幼苗的研究結果表明，高溫對氣孔密度的影響因品種而異，部分品種的氣孔密度隨溫度增加而增加，也有一些品種的氣孔密度沒有變化；Jumrani 等［19］研究發現，隨著溫度的升高，大豆葉片遠軸面和近軸面的氣孔數量均顯著增加，蒸騰速率加快。此外，氣孔孔徑寬度和氣孔導度決定了單個氣孔的CO2通過量，Zhang 等［20］研究了不同濃度CO2和溫度的交互作用對番茄葉片氣孔孔徑的影響，發現在高濃度CO2條件下，高溫導致番茄葉片氣孔孔徑寬度減小，最終使水分散失和植株耐熱性之間達到平衡；梁雯［21］通過研究高溫對杜鵑葉片氣孔及光合特性的影響，發現高溫導致其氣孔導度改變，從而降低細胞間隙CO2摩爾分數、凈光合速率、蒸騰速率及水分利用率。

目前，不同耐/感玉米自交系苗期的植株性狀、氣體交換過程和氣孔特性對高溫脅迫的響應及其恢復狀態尚不清楚。因此，根據前期篩選的結果，利用人工氣候室模擬增溫，對耐熱性差異較大的2 個玉米自交系進行研究，以玉米苗期高溫脅迫及恢復的基因型差異為切入點，研究高溫脅迫對玉米苗期葉片氣孔特性和氣體交換參數的影響以及高溫條件下它們之間的關系，旨在為豐富耐熱型玉米種質資源提供理論依據，有助于為未來氣候變化下的夏玉米生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 植株培養及處理

供試玉米材料為前期研究中篩選出的耐熱型自交系13HF1849 和敏感型自交系14HF1406。選取子粒飽滿且大小一致的種子，用質量分數為0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒，然后用去離子水沖洗干凈后放入燒杯，加溫水沒過種子浸泡8 h，再用去離子水沖洗，將種子放入鋪有濾紙的培養皿，加去離子水至淹沒濾紙并有淺水層，在28 ℃恒溫培養箱催芽。

取試驗田耕層土壤曬干后過1 cm 篩，每盆（直徑16 cm，高17 cm）加200 g 有機質、4 g 過磷酸鈣和12 g 氯化鉀混合，將混合后的土裝至盆缽刻度線，每個自交系各選擇10 粒生長發育良好的種子移栽至盆缽，在人工氣候室中培育（晝/夜氣溫：26/23 ℃，白天/夜間光周期：14/10 h，濕度60%，CO2濃度為450～480 mg/kg）。

在植株即將進入六葉一心期時，分別放入38 ℃（HT）和28 ℃（CK）條件下處理［22，23］，其他環境參數不變。當每盆植株在第7 片葉完全展開時，測量該葉片的生理指標、光合、氣孔、氣體交換等參數。然后將2 組植株放入常溫（28 ℃）條件下恢復，直到第9片葉完全展開，再次測量第9 片葉的所有參數。

1.2 測定內容與方法

1.2.1 植株性狀的測定 在試驗期內，記錄每片葉完全展開所需天數，以計算出葉速率，出葉速率為完全展開葉片的數量除以葉片完全展開所需的天數；待植株第7 片葉與第9 片葉完全展開后，用卷尺測量株高，并用Li-3000 型葉面積儀測定第7 片葉與第9片葉的葉面積；用SPAD502 型葉綠素儀測量葉基部、葉中部和葉尖3 個部位的葉綠素相對含量，每個部位重復測定5 次，求其均值。

1.2.2 氣體交換參數的測定 當植株生長至第7 片葉與第9 片葉完全展開后，用Li-6400 型便攜式光合測定系統測定每盆植株第7 片葉與第9 葉葉基部、葉中部和葉尖部的凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率等氣體交換參數，測量時的葉室環境條件為光照度1 000 μmol/（m2·s），濕度60%，溫度為38/28 ℃，CO2濃度為480 mg/kg，植株的穩定時間為2.5～5.0 min。以葉基、葉中、葉尖3 個部位的均值為最終參數。瞬時水分利用效率為凈光合速率與蒸騰速率的比值，潛在水分利用效率為凈光合速率與氣孔導度的比值［24］。

1.2.3 氣孔性狀的測定 與氣體交換參數測定的時間和葉片一致，采用印跡法取樣，在每盆植株第7 片葉與第9 片葉的葉基部、葉中部和葉尖部位涂上無色透明的指甲油，采集面積為20 mm×10 mm，用膠頭滴管在載玻片上滴一滴去離子水，待葉片上的指甲油風干后，用鑷子撕下薄膜放在載玻片的水滴上，展開鋪平，蓋上蓋玻片，自然晾干備用。

將帶有氣孔印記樣品的載玻片用裝備有相機的Nikon 顯微鏡觀察（YS100 型，尼康株式會社），隨機選擇3 個視野拍照，每個視野拍3 張照片，利用配套軟件系統對每張照片的氣孔密度、表皮細胞密度進行統計和計算，每張照片選取10 個氣孔測量氣孔孔徑寬度、氣孔最大長度、氣孔最大寬度以求氣孔面積。氣孔和表皮細胞密度表示為單位面積內氣孔和表皮細胞的數量。氣孔孔徑寬度是指氣孔兩端保衛細胞連接處之間的長度。氣孔面積=氣孔最大長度×氣孔最大寬度×3.14×0.25。

1.3 數據處理與分析

數據均采用Microsoft Excel 和DPS 統計軟件進行分析。用Pearson 相關性檢驗分別分析了高溫條件下氣孔的性狀與光合生理參數的關系。采用t檢驗分析了高溫與對照各參數的差異。

2 結果與分析

2.1 不同耐/感玉米自交系植株及葉片生理指標對高溫的響應及其恢復

由圖1、圖2 可知，與對照組相比，高溫處理使熱敏感型自交系植株第7 片葉的葉面積、株高和SPAD分別下降了39、33 和31 個百分點，下部葉片出現大面積的萎蔫、褐化和黃化，部分新葉也逐漸呈相似趨勢，生長明顯受到抑制；相反，耐熱型自交系受高溫影響較小，在高溫條件下的生長趨勢與常溫對照相比無較大差異，SPAD甚至增加了9 個百分點。2 個自交系的出葉速率均受到顯著影響，呈減緩趨勢。

圖1 高溫處理及常溫恢復對耐熱型自交系13HF1849（a、b）和熱敏感型自交系14HF1406（c、d）植株表型的影響

圖2 高溫處理及常溫恢復對耐熱型自交系13HF1849 和熱敏感型自交系14HF1406 葉面積（a、b）、株高（c、d）、葉綠素相對含量（e、f）和出葉速率（g、h）的影響

經過28 ℃恢復期后，2 個自交系第9 片葉僅出葉速率能與常溫對照保持一致，熱敏感型自交系由于高溫處理導致的葉面積、株高和SPAD并沒有隨著溫度降低而恢復，但是耐熱型自交系的葉面積和株高呈緩慢回升的趨勢。

2.2 不同耐/感玉米自交系氣體交換參數對高溫脅迫的響應及其恢復

如圖3 所示，與常溫對照相比，高溫導致熱敏感型自交系的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、潛在水分利用效率（iWUE）和氣孔導度（Gs）分別下降25、17、2 和24 個百分點；而耐熱型自交系呈相反趨勢，Pn、Tr、iWUE和Gs分別增加12、49、25 和41 個百分點，且均高于熱敏感型自交系，其中Tr和Gs最為顯著；但是，高溫脅迫使2 個自交系的瞬時水分利用效率（WUE）顯著降低，且耐熱型自交系的WUE低于熱敏感型自交系。經過常溫恢復期后，與對照相比，熱敏感型自交系高溫處理組（第9 片葉）的所有氣體交換參數均有不同程度的下降，但耐熱型自交系的Tr、iWUE和Gs仍高于對照組。

圖3 高溫處理及常溫恢復對耐熱型自交系13HF1849 和熱敏感型自交系14HF1406 氣體交換參數的影響

2.3 不同耐/感玉米自交系葉片氣孔特征對高溫的響應及其恢復

2 個玉米自交系的氣孔特性對高溫脅迫的響應一致，如圖4 所示，與對照組相比，高溫處理導致2 個自交系的氣孔密度（SD）、氣孔孔徑寬度（SW）和氣孔面積（SA）均顯著增加。耐熱型自交系和熱敏感型自交系的SD分別比對照組增加了30 和27 個百分點，SW分別增加了26 和23 個百分點，SA分別增加了39 和77 個百分點，且熱敏感型自交系所有的氣孔參數均低于耐熱型自交系。經過28 ℃常溫恢復后，耐熱型自交系和熱敏感型自交系第9 片葉的SD 分別高于對照組39 和63 個百分點，但此時的SW 和SA低于對照組。

圖4 高溫處理及常溫恢復對耐熱型自交系13HF1849 和熱敏感型自交系14HF1406 葉片氣孔特征的影響

2.4 高溫條件下不同耐/感玉米自交系的凈光合速率和潛在水分利用效率與氣孔參數和SPAD 之間的關系

由圖5、圖6 可知，在高溫條件下，2 個試驗材料的凈光合速率分別與氣孔導度、SPAD和氣孔孔徑寬度之間存在顯著或極顯著正相關關系，而潛在水分利用效率僅與氣孔導度和氣孔孔徑寬度呈顯著或極顯著正相關關系。耐熱型自交系的凈光合速率與氣孔導度和SPAD之間的相關性較高，而熱敏感型自交系的凈光合速率與氣孔孔徑寬度和SPAD之間的相關性較高。耐熱型自交系的潛在水分利用效率與氣孔導度和氣孔孔徑寬度之間的相關性較高，熱敏感型自交系的潛在水分利用效率與氣孔孔徑寬度之間的相關性也較高。

圖5 高溫條件下耐熱型自交系13HF1849 和熱敏感型自交系14HF1406 不同指標與凈光合速率的相關性

圖6 高溫條件下耐熱型自交系13HF1849 和熱敏感型自交系14HF1406 不同指標與潛在水分利用效率的相關性

3 討論

研究結果表明，不同耐/感玉米自交系對高溫脅迫的響應不同，38 ℃高溫使熱敏感型自交系苗期的葉面積、株高、葉綠素相對含量和出葉速率呈下降趨勢。這與前人的研究結果相似，當溫度上升到28 ℃以上時，植株生長開始受到影響，當日平均溫度在30 ℃或35 ℃以上時，株高、總生物量、葉綠素含量和比葉面積呈線性下降［25，26］，40 ℃是玉米營養生長階段的溫度極限［27］。由于高溫導致葉綠素降解，從而造成植株葉片黃化，有機物合成量減少，最終影響到生物量［28］。而高溫條件下耐熱型自交系的葉面積、株高和植株生長狀況與常溫對照相比沒有顯著差異，葉綠素相對含量甚至呈上升趨勢。由此推測，不同溫度條件下植株葉面積和株高等表型生長參數存在顯著差異可能與2 個自交系的光合性能有關。

本研究結果表明，熱敏感型自交系的凈光合速率下降了25 個百分點，而耐熱型自交系的凈光合速率上升了約12 個百分點。一些學者在早期進行了類似研究，發現高溫處理后常規番茄品種的凈光合速率顯著降低，而抗性品種植株在遭遇高溫脅迫后沒有出現降低的趨勢［29］。本研究中出現了抗性自交系的光合速率不降反升的結果，或許與其氣孔特性有關。吳冰潔［30］通過研究玉米和高粱的氣孔發現，無論是近軸面還是遠軸面的氣孔受到抑制，都會導致光合速率降低，且抑制遠軸面氣孔會導致光合速率降低幅度更大，不同作物及其不同品種植株的氣孔對環境的敏感性差異可能是通過改變CO2分壓來影響其垂直擴散。

前人的研究認為，氣孔孔徑和氣孔導度分別與凈光合速率和水分利用效率呈負相關關系，而與蒸騰速率呈正相關關系［20］。在不同水分條件下，氣孔導度分別與凈光合速率和潛在水分利用率呈負相關關系［31］。植物葉綠素含量和光合作用性能之間也存在相關性，葉綠素含量越高，玉米葉片的凈光合速率越高，氣孔導度和蒸騰速率越大［32，33］。通過分析本研究結果之間的相關關系發現，在高溫條件下，2個玉米自交系的凈光合速率分別與氣孔導度、氣孔孔徑寬度和葉綠素相對含量呈顯著或極顯著正相關關系，而潛在水分利用效率與氣孔導度和氣孔孔徑寬度呈顯著或極顯著正相關關系。

本研究中，增溫降低了敏感型自交系的潛在水分利用率和蒸騰速率，而耐熱型自交系則呈相反的趨勢。高溫條件下光合性能、蒸騰和水分利用效率變化的主要原因可能是熱脅迫引起的氣孔狀態變化（氣孔密度、氣孔孔徑寬度和氣孔面積）。有學者認為，氣孔密度與凈CO2同化率和瞬時水分利用效率呈正相關關系［34］。本研究結果表明，高溫對2 個供試自交系也產生了類似的影響，在高溫脅迫下，自交系的氣孔密度、氣孔孔徑寬度和氣孔面積顯著增加，且耐熱型自交系的基數和增長率均高于熱敏感型自交系。因此，耐熱型自交系受高溫脅迫的影響較小，這可以歸因于其較高的散熱效率，通過改變氣孔數目以及單個氣孔的孔徑大小和形狀來改變葉片氣孔分布格局和每片葉的氣孔總面積［35］。Feller［36］的研究也得到相似的結果，菜豆葉片在20 ℃到50 ℃下的氣孔開度不同，在溫度為23、30 和35 ℃時，氣孔孔徑分別為0.66、2.76 和4.28 μm。此外，氣孔導度和孔徑大小決定光合作用吸收的CO2量，并通過蒸騰作用控制水分散失量，促進蒸發冷卻和養分的吸收［37，38］。本研究結果表明，高溫增加了抗性自交系的氣孔導度、孔徑寬度和SPAD，而熱敏感型自交系則表現出相反的結果，這與2 個試驗材料的光合特性變化趨勢一致。推測2 個自交系在高溫條件下的光合特性的差異與其氣孔導度、氣孔孔徑以及SPAD存在聯系。

另外，氣孔的發育狀態也是影響植株光合作用的重要因素，氣孔發育可以通過改善氣體交換來緩和氣孔限制，從而提高光合性能和蒸騰散熱。溫度是植物感知到的主要環境信號，能誘導一系列發育和形態變化，包括器官生長、花期和氣孔數量等［39］。玉米等單子葉植物氣孔的發育過程需要經過多個階段，由表皮原細胞形成保衛細胞母細胞，再逐漸分裂形成保衛細胞和副衛細胞，最終形成成熟的氣孔復合體［40］。氣孔譜系的前體細胞，即分生組織母細胞（MMC）和分生組織能進行自我更新，這些前體細胞的發育和變化決定了氣孔和表皮細胞的數量和比例，同時，也由于形成過程中環境的差異造成一定的氣孔大小差異。氣孔前體細胞的啟動和復制是由SPCH 蛋白驅動的，它可以通過調節多個基因來促進前體細胞的分裂和形態轉換，并接收外界信號，影響氣孔譜系的活動［41，42］。SPCH 蛋白由MAPK 蛋白激酶和油菜素類固醇（BR）信號通路為靶向，高溫等外界脅迫通過降低MAPK 活性來抑制SPCH 蛋白活性，從而影響氣孔譜系活動［43，44］。由于SPCH 蛋白在氣孔譜系發育中具有重要作用，所以推測，SPCH 或許是高溫脅迫導致本研究中2 個自交系氣孔導度、密度以及氣孔孔徑寬度增加的原因。另外，PIF4（Phytochrome-interacting factor 4）是高溫感知下游的直接信號，在接收到高溫信號后，能夠調節氣孔發育，缺少PIF4 的植物在高溫條件下會表現出缺陷反應。有前人研究了野生型和PIF4 突變體植株對高溫的響應，發現野生型植株氣孔密度呈下降趨勢，而突變體植株在高溫條件下的氣孔密度與常溫對照相比無顯著差異，而且高溫條件下，PIF4 能促進SPCH充分積累，以確保氣孔細胞的分化［45］。因此，推測高溫條件下耐熱型自交系氣孔參數基數大于敏感型自交系，取決于其SPCH 和PIF4 的表達量，但是具體的結果還需進一步研究驗證。

本研究中2 個自交系在高溫條件下的瞬時水分利用率均顯著降低，雖然提高蒸騰速率是保護植物免受高溫危害的重要措施之一，但同時也要減少水分損失以實現高效用水。這與前人的一些研究結果相似，適當的高溫（35 ℃）可以增加抗性品種的潛在水分利用率，但當溫度上升到閾值時（40 ℃）便開始降低，同時，常規品種在35 °C 和40 °C 條件下的潛在水分利用率高于正常溫度［24］。本研究的結果雖然不能完全描述成熟或整株植物的反應，但仍然表明，在高溫脅迫下，植物經歷了防止水分流失和蒸騰散熱之間的權衡。

經過常溫恢復期后，2 個供試自交系的凈光合速率和氣孔孔徑寬度均低于對照組，抗性自交系的光合參數和氣孔參數均高于敏感型自交系。耐熱型自交系的蒸騰速率、潛在水分利用效率和氣孔導度均高于對照組，而敏感型自交系則呈相反趨勢。張潔等［46］通過研究高溫及其恢復對光合特性的影響發現，氣孔限制因素是高溫處理后處于常溫恢復期植株光合作用下降的重要原因。在38 ℃的高溫條件下，玉米植株發生了一系列變化，即使是經過常溫恢復，敏感型自交系的表型特征在短期內難以恢復到正常生長水平，呈持續的熱損傷狀態。耐熱型自交系能很快恢復，或許與其非光化學能量耗散增加和HSP101 蛋白誘導啟動光化學修復有關，使其具有更耐熱的光合系統以及有效的光合修復機制［47］。

4 小結

與熱敏感型自交系相比，耐熱型自交系在高溫條件下表現出更高的光合和水分利用穩定性，在高溫脅迫后恢復更快，這主要是由于耐熱型自交系具有較大的氣孔導度、氣孔孔徑寬度和葉綠素含量，使CO2同化率增加，最終使光合效率增強，水分利用率提高。經過常溫恢復后，熱敏感型自交系在短期內難以恢復到正常生長水平，呈持續的熱損傷狀態，而耐熱型自交系則有更強的恢復適應能力。