氣流因子差異化做青工藝對烏龍茶香氣品質的影響

周子維，魏瑩瑩，吳晴陽，范麗君，饒泓婷，陳援援，吳靈貞，戴彬彬，蔡烈偉，鄭世仲，王 芳，孫 云

·農產品加工工程·

氣流因子差異化做青工藝對烏龍茶香氣品質的影響

周子維1,2，魏瑩瑩1,3，吳晴陽2，范麗君1，饒泓婷1，陳援援1，吳靈貞1，戴彬彬1，蔡烈偉1，鄭世仲1，王 芳1，孫 云2※

（1. 寧德師范學院生命科學學院/寧德師范學院茶葉審評中心，寧德 352100；2. 福建農林大學園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室，福州 350002；3. 福建農林大學食品科學學院，福州 350002）

為探究氣流因子在烏龍茶做青工藝中對其香氣品質的影響，以鮮葉（CK）、常氧搖青葉（Ta）和乏氧搖青葉（Tb）及相應的毛茶a（Ma）和毛茶b（Mb）為試材，利用半定量反轉錄聚合酶鏈式反應（Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）、頂空固相微萃取法（Head-Space Solid-Phase MicroExtraction，HS-SPME）與氣相色譜-飛行時間質譜聯用（Gas Chromatography-Time-Of-Flight Mass Spectrometry，GC-TOF MS）等技術，通過多元統計分析等方式，對不同氣流因子介導做青工藝的烏龍茶揮發性組分進行分析。結果表明：Tb中低氧脅迫響應因子和基因的表達水平相較Ta和CK有所上調，基于毛茶中共鑒定出的205種揮發性組分，采用最小偏二乘法（Partial Least Squares，PLS）分析表明，以重要性投影指標值（Variable Important Projection，VIP）大于1.0為篩選條件，獲得標志性差異揮發性成分有24個，其中吲哚的VIP值最大（4.75），-法呢烯（3.06）、羅勒烯異構體混合物（2.77）、反式-橙花叔醇（2.75）等隨后。乏氧搖青葉有5種特征差異揮發性組分，而常氧搖青葉中僅2種。毛茶感官審評結果發現，常氧搖青處理葉付制的烏龍茶香氣清香持久，花香較顯（香氣感官得分90.67）。Ma中反式-橙花叔醇、2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、異植物醇、亞硫酸-2-乙基己基丁酯、6-氮雜雙環[3.2.1]辛烷的含量均顯著高于Mb（<0.05），推測該5個物質可能是常氧搖青條件下形成較優品質烏龍茶的標志性代謝物，這有助于更好理解氣流因子對搖青過程中香氣物質代謝的影響，研究結果為探究環境因子介導下搖青工藝對烏龍茶香氣品質的形成機制提供理論基礎。

香氣；品質控制；烏龍茶；氣流；做青；揮發性組分；最小偏二乘法

0 引 言

作為中國傳統六大茶類之一，烏龍茶以其天然馥郁的花果香聞名。有別于綠茶和紅茶，半發酵的烏龍茶香氣品質主要通過做青環節形成[1]。做青是對萎凋適度的青葉反復進行搖青和攤放的過程，做青方式、搖青強度、靜置時長、攤葉厚度等工藝參數在不同程度上影響烏龍茶香氣品質的形成，做青過程中的以“溫、濕、風”為代表的環境因子也是形成烏龍茶品質的重要影響因素[2-4]。溫度是影響烏龍茶香氣品質的重要因素。做青環境溫度過低，滋味單薄，香氣清細且帶青氣，而溫度過高，“走水”過快，不利于芳香物質的形成[5]。徐安安等[6]發現高溫會引起強烈的呼吸作用及酶促氧化，消耗較多氨基酸和可溶性糖，不利于茶葉香氣、滋味的形成；而中低溫有利于降低鮮葉呼吸速率，促進香氣物質形成和保留。鄧慧莉等發現在低溫條件（15 ℃）下，橙花叔醇、吲哚、芳樟醇等[7]多種芳香物質含量顯著提高，而高溫（35 ℃）條件下只有法呢烯的相對含量大幅積累；王芳等[8]發現在24 ℃下做青的大紅袍茶品質表現最佳。不同濕度使得烏龍茶香氣表現呈現明顯差異。陳林等[9]對在相對濕度71%±4%條件下做青的清香型烏龍茶、閩南烏龍茶和閩北烏龍茶的特征香氣組分進行主成分分析，發現主要與吲哚、反式橙花叔醇、苯乙醛和法呢烯有關，這些香氣成分可作為判別香氣品質的化學指標。劉寶順等[10]研究發現環境相對濕度越低越有利于葉子水分的散失、酶活性增強，茶多酚越易被氧化，次級氧化產物和茶褐素的含量也較低；反之，濕度越高，次級氧化產物和茶褐素總量因做青時間延長而積累增多，不利于武夷巖茶品質的形成。陳倩蓮[11]等發現做青環境空氣相對濕度為70%～80%時更有利于大紅袍做青品質的形成，經感官審評發現毛茶以相對濕度70%的品質最佳。

而氣流是溫、濕度的載體，在加工過程中往往容易被忽略，且氣流因子在做青過程中對烏龍茶香氣品質有著不可或缺的作用。前人研究表明，在茶葉加工過程中適當通風能減少葉片的含水量，促進青葉和空氣中的水分交換，有利于青葉水分的釋放和優異品質的形成[12-13]；金心怡等[4]研究發現，做青過程應該注意調節和控制氣流因子，氣流因子包含空氣流速、氣流組織形式等因素；王秀萍等[14]研究表明春茶和暑茶均以恒溫恒風下處理的香氣、滋味最優；郝志龍等研究表明，振動做青葉的水分損失比傳統做青多，細胞損傷率也比空調做青高[15]。周子維等[16]研究表明，氣流因子從脂氧合酶-氫過氧化物（Lipoxgenase-Hydroperoxide Lyase，LOX-HPL）途徑介導了烏龍茶香氣品質的形成途徑。

然而，目前關于做青過程中氣流因子對烏龍茶香氣的影響的研究尚不多見。作者所在課題組對（Hypoxia-induced protein）基因家族進行了篩選和分析，通過對常氧和乏氧搖青葉中的半定量RT-PCR（Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction）分析，確定不同處理下形成的微環境低氧脅迫，并以常氧和乏氧搖青葉付制的烏龍茶毛茶為試材，采用頂空固相微萃取法（Head-Space Solid-Phase MicroExtraction，HS-SPME）結合氣相色譜—飛行時間質譜聯用（Gas Chromatography- Time-Of-Flight Mass Spectrometry，GC-TOF MS），對烏龍茶揮發性成分進行鑒定分析[17]，結合毛茶感官審評和多元統計分析等手段，構建氣流因子介導做青的烏龍茶揮發性組分代謝譜，明確烏龍茶特征揮發性組分對氣流的響應模式，為今后烏龍茶加工過程中香氣品質的調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以種植于福建農林大學（金山校區）茶學教學實踐基地（26°04? N，119°14? E）的國家級茶樹良種‘黃旦’（cv. Huangdan）為試驗材料，采摘時間為2020年秋季，鮮葉的采摘標準為健康、無病蟲害的“一芽三葉”，對采后鮮葉進行日光萎凋（26 ℃，150 000 lx），萎凋時長為30 min，將適度的萎凋葉（W）均等地分為2組后，分別投入搖青機的子筒a和子筒b中（子筒a與子筒b間以木板隔離），子筒a中微環境為常氧狀態，子筒b以黑色塑料膜進行全面覆蓋，營造乏氧微環境。參照課題組先前研究的做青方式[16,18]，做青對萎凋葉進行3次搖青處理，每次搖青的時長為5 min，搖青機轉速為40 r/min，每次搖青期間進行30 min的晾青處理（筒內進行），做青過程總歷時約為120 min，以鮮葉呈湯匙狀、綠葉紅邊明顯、花果香濃郁為標準做青葉，將子筒a和子筒b的做青葉分別記為Ta和Tb，隨后依照烏龍茶加工標準，對Ta和Tb進行殺青→揉捻→干燥等的相同處理，獲得常氧和乏氧處理條件下的毛茶a（Ma）和毛茶b（Mb）。所有的采后處理均在福建農林大學茶學教學科研實踐基地茶廠二樓車間進行，取樣當天車間室內溫度24 ℃、相對濕度45%，東南風3～4級。對每次處理的取樣進行3次重復，以錫箔紙包好，采用液氮進行固樣，其中茶樹鮮葉（CK）在離體后30 s內完成田間取樣和固樣，Ta和Tb在處理完成后1 min內完成取樣和固樣，固定后的樣品放置于超低溫（?70 ℃）冰箱中保存備用，Ma和Mb則置于4 ℃冰箱保存備用（圖1）。

注：CK表示鮮葉；W表示萎凋葉；Ta表示烏龍茶常氧做青葉；Tb表示烏龍茶乏氧做青葉；Ma表示常氧做青付制的烏龍茶；Mb表示乏氧做青葉付制的烏龍茶。下同。

1.2 主要試劑和設備

主要試劑：DP441多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）（北京天根生化科技有限公司），去除基因組污染（gDNA Eraser）反轉錄試劑盒購于（寶日醫生物技術（北京）有限公司），DreamTaq Green酶，GelGreen熒光核酸凝膠染色試劑（美國Biosharp公司），D2000 DNA Ladder。

主要儀器設備：6CYQT-60型搖青機、Allegra 64R高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司）、LY500-O2手持泵吸式氧氣氣體檢測儀（深圳立業實業有限公司）、QDF-3型熱球式電風速計（天津氣象海洋儀器廠）、氣相色譜-質譜聯用儀包括：MPS多功能自動進樣架（德國哲斯泰公司），7890B氣相色譜（美國安捷倫科技公司），Pegasus HT飛行時間質譜（美國力可公司）、凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）、電泳凝膠成像系統（美國伯樂公司）、T100 PCR儀（美國伯樂公司）、超微量分光光度計（美國賽默飛世爾公司）。

1.3 RNA的抽提及cDNA的合成

稱取CK、Ta和Tb各0.5 g試材，用總RNA提取試劑盒（過濾柱法），嚴格參照試劑盒說明書抽提取在制品茶樣的總RNA并檢測完整性、濃度及純度，并依照說明書將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，將得到的cDNA轉移至于?20 ℃條冰箱中備用。

1.4 半定量PCR試驗

使用熱循環儀進行半定量RT-PCR檢測相關基因的表達水平，基因作為內參基因[19]，采用DNAMAN 8.0軟件設計茶樹相關基因的半定量RT-PCR引物（表1）。PCR擴增反應體系為25L：12.5L Dream Taq Green DNA聚合酶，9.5L ddH2O，1L 模板cDNA（400 ng/L），1L上下游每種引物（10 nmol/mL）。RT-PCR半定量擴增條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增子用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，以凝膠成像系統拍照。

表1 相關候選基因的半定量RT-PCR特異性引物

1.5 感官審評

以烏龍茶感官審評方法（GB/T 23776-2018）對烏龍茶茶樣進行審評。稱取Ma和Mb各5.0 g毛茶茶樣，置于110 mL蓋碗中，注滿沸水分別沖泡2、3和5 min后濾出茶湯。審評過程由3位國家高級評茶員進行“五項因子”感官審評，側重對香氣進行審評，評語引自GB/T 14487-2017。

1.6 GC-TOF MS檢測揮發性物質

稱取2.0 g茶葉粉末于20 mL頂空瓶中，SPME法進行揮發性物質的提取，通過GC-TOF MS對提取到的揮發性物質進行檢測。

SPME條件：萃取針：PDMS/DVB（23 Ga，Plain，65m，美國 Supelco公司）；孵育溫度：80 ℃；孵育時間：31 min；萃取時間：60 min；解析時間：3.5 min。

色譜條件：色譜柱：Rxi?-5silMS（30 m×0.25 mm× 0.25m）；進樣口溫度：250 ℃；傳輸線溫度：275 ℃；載氣：氦氣；氦氣流速：1 mL/min；程序升溫：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min的速率升至210 ℃，保持3 min，以15 ℃/min的速率升至230 ℃；不分流進樣品。

飛行時間質譜條件：溶劑延遲時間：300 s；掃描范圍：30～500 amu；采集速率：10 Spec/s；檢測器電壓：1 530 V；EI電離能量：70 eV；離子源溫度：250 ℃。

1.7 數據分析

利用ChromaTOF version 4.51.6（美國LECO公司）軟件對GC-TOF MS采集的數據進行峰對齊、解卷積等處理，通過搜索NIST數據庫進行揮發性物質鑒定，并利用Simca-P14.0軟件進行多元統計分析。采用Graphpad Prism 6.0和PASW statistics 18.0對試驗數據進行分析及制圖，采用Tukey Honestly Significant Difference（HSD）test進行差異顯著性分析，采用皮爾遜（Pearson）相關系數作為衡量變量間的線性關系，顯著性采用雙側檢。

2 結果與分析

2.1 子筒內氧氣含量的評估及CsHIG基因的半定量表達分析

利用氧氣氣體檢測儀對做青車間、子筒a和子筒b空間內進行氧氣含量的檢測，數據顯示，子筒a的氧氣含量介于20.3%～20.8%之間，除去2個異常值，子筒a的氧氣含量（20.4%）與做青車間的氧氣含量（20.7%）間不存在顯著差異，而與子筒b內的氧氣含量（16.7%）存在極顯著差異，這說明子筒a和子筒b在做青期間的分別滿足常氧和乏氧的搖青條件。對子筒a和子筒b內部的氣流速度進行檢測，數據顯示，做青期間子筒a的氣流速度介于0.24～0.28 m/s之間，子筒b的氣流速度介于0.05～0.08 m/s之間，二者間存在極顯著差異（<0.01）。

注：**表示2個處理之間差異極顯著（P<0.01）。

為進一步證明青葉樣品對乏氧環境存在應激響應，開展對青葉中低氧脅迫誘導因子基因的表達分析。對試樣中抽提的總RNA質量檢測結果顯示，鮮葉（CK）、烏龍茶常氧做青葉（Ta）以及乏氧做青葉（Tb）中提取的總RNA質量濃度均大于500 ng/L，A260/A280比值均介于2.00至2.10之間，同時，瓊脂糖凝膠電泳結果表明，所有樣品的18 S和28 S條帶清晰、完整，且能較好地分離（圖3）。該結果證明樣品中做青葉的總RNA并未發生嚴重降解，且保持著較高的純度、濃度和完整性，質量符合要求，可開展后續試驗。

圖3 不同處理葉的總RNA電泳圖及CsHIG基因表達的RT-PCR分析

低氧誘導因子（Hypoxia-Induced Factor, HIF）是植物響應低氧環境脅迫的應激蛋白，以CK、Ta和Tb的cDNA為模板，通過對HIF 相關基因和的半定量RT-PCR分析，結果發現，常氧和乏氧的2種做青方式均促進了基因的表達水平的提升，其中Tb處理對4基因的表達水平有明顯的上調作用。RT-PCR半定量試驗結果可證明，子筒b做青處理確能引起氧氣缺乏微環境，進而為后續常氧做青和乏氧做青烏龍茶的揮發性組分的比較奠定了基礎。

2.2 烏龍茶毛茶感官審評品質分析

為明確烏龍茶毛茶的感官香氣品質，按照國標法[20]對常氧做青付制的烏龍茶（Ma）和乏氧做青葉付制的烏龍茶（Mb）進行“五項因子”感官審評（表2），側重于評價內質香氣和滋味，結果表明：Ma的香氣優雅且清長，花香和黃旦的“品種香”顯，而Mb香氣雖有花香和黃旦的“品種香”，但較沉悶，欠愉悅，Ma的感官香氣得分極顯著高于Mb（0.01）；在滋味的審評結果則表明，Ma滋味鮮醇爽滑，微有火味；Mb滋味醇和、較濃厚，有酵味，略帶苦尾，Ma的感官滋味得分顯著高于Mb（0.05）。綜上，Ma在內質香氣和滋味的表現上要總體優于Mb。

表2 常氧搖青葉和乏氧搖青葉的感官審評結果

注：*表示2個處理之間差異顯著（<0.05）；**表示2個處理之間差異極顯著（<0.01），下同。

Note: * indicated significant difference between the two treatments (<0.05); ** indicated that the difference between the two treatments was extremely significant (<0.01). The same below.

2.3 揮發性組分總體輪廓及韋恩圖分析

從試驗材料中共鑒定出205種揮發性組分，通過歸類與分析，得到烷烴類最多共有50種，酯類（45種）次之。鮮葉經不同搖青處理，除了醛類和烷烴類，其他6類呈現相同變化趨勢。其中酯類的相對含量波動最大，經乏氧搖青處理，酯類含量下降速度為常氧搖青葉的4.74倍。相較于CK，醛類和烷烴類在Ma中分別降低了0.77%、0.35%，而在Mb中卻分別增長了0.36%、1.31%（圖4a）。Upset圖（多重對比圖）是采用固定位置的交叉環形式用封閉曲線表示集合及其關系的圖形，利用韋恩圖進行不同組間差異代謝物多重比較分析，尋找共揮發性組分。CK、Mb、Ma香氣組分數量分別為36、86、167。結果如圖4b所示，在CK、Ma和Mb這3組比較組間尋找到33種共有揮發性組分，且大多數以醇類為主（8種）、烯烴類次之（7種）；Ma和Mb這兩組存在52種共有的揮發性組分。CK中有3種差異代謝物，如(-)-Α-蓽澄茄油烯、2,6-二甲基-1,3,6-庚三烯、糠醛，Mb中僅有(Z)-丙酸-3-己烯酯這1種特有差異代謝物，而Ma有高達82種差異代謝物（圖4b）。

2.4 不同氣流因子介導做青處理烏龍茶的多元統計分析

基于鑒定獲得的揮發性物組分，通過Chroma TOF軟件處理后，利用最小偏二乘法（Partial Least Squares，PLS）模型，分析獲得主成分的特征值和方差貢獻率，結果如表3所示，第一主成分（F1）的貢獻率為34.7%，第二主成分（F2）的貢獻率為35.1%，二者的貢獻率累69.8%，PLS散點圖較清晰地展示了兩者在PC1和PC2上的分布區間差異（圖5a），同時HCA聚類分析也證明Ma和Mb中所對應的主成分能夠達到良好的聚類效果（圖5b），這都表明F1和F2足以區分Ma和Mb所對應的主要揮發性成分。

表3 不同搖青處理葉揮發性成分的最小偏二乘法的特征值及方差貢獻率

在PLS模式下生成變量投影重要性分析值（Variable Important for the Projection，VIP），以VIP>1為篩選條件[21-22]，以量化每個揮發性組分在不同搖青處理葉的貢獻程度。在該模式下，共篩選獲得24種揮發性組分（表4），結合PLS得分圖，可知在常氧搖青處理對應區域的特征揮發性組分有：亞硫酸-2-乙基己基丁酯、反式-橙花叔醇、(Z)-Z-四氫-6-(2-戊烯基)-2H-吡喃-2-酮、6-氮雜雙環[3.2.1]辛烷等7個揮發性物質；乏氧搖青處理對應區域的特征揮發性組分有：三氯乙酰薰甲酸二乙酯等17個揮發性組分（圖5c、圖5d）。

注：QC表示混樣質控。104為吲哚、10為α-法呢烯、15為羅勒烯異構體混合物、20為反式-橙花叔醇、53為2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、112為橙花叔醇、6為反-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯、98為2-甲基-十六烷醛、14為3，7，11-三甲基-1，3，6，10-十二碳四烯、83為鄰苯二甲酸二乙酯、54為6-甲基-5-庚烯-2-酮、102為己酸-3-己烯酯、39為Z-四氫-6-(2-戊烯基)-2H-吡喃-2-酮、123為苯乙醇、124為鄰苯二甲酸，2-氯丙基異丁酯、141為三氯乙酰薰衣草醇、13為鄰苯二甲酸二異丁酯、106為異植物醇、87為正二十烷、19為脫氫芳樟醇、67為苯乙腈、130為亞硫酸-2-乙基己基丁酯、59為14-甲基-8-十六烷烯醛、57為6-氮雜雙環[3.2.1]辛烷。其他編號含義見表4。

2.5 不同搖青處理葉特征揮發性組分的差異性分析

為進一步明確不同搖青葉中的特征揮發性組分，以相對含量為縱坐標，對烏龍茶在不同搖青處理下篩選獲得的24種特征揮發性物質（表5）的揮發性含量進行差異性分析。結果發現，Ma中2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、亞硫酸-2-乙基己基丁酯的含量分別是Mb的2.3倍、1.2倍；Mb中羅勒烯異構體混合物、反-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯、鄰苯二甲酸二乙酯、三氯乙酰薰衣草醇、正二十烷的相對含量分別是Ma的1.7倍、1.2倍、1.3倍、1.1倍、1.1倍。同時，這些物質的Ma與Mb組間相對含量差異均達到極顯著（<0.01）。Ma中反式-橙花叔醇、Z-四氫-6-（2-戊烯基）-2H-吡喃-2-酮、異植物醇、6-氮雜雙環[3.2.1]辛烷的含量分別是Mb的1.1倍、2.3倍、1.7倍、1.4倍。這4個物質的Ma與Mb組間相對含量存在顯著差異（<0.05）。而吲哚、-法呢烯、橙花叔醇等13個物質的Ma與Mb組間相對含量差異并不顯著（>0.05）（表5）。通過對常氧搖青毛茶（Ma）和乏氧搖青毛茶（Mb）特征揮發性組分數量與香氣、滋味感官審評得分的相關性分析發現，特征揮發性組分數量與香氣感官評價得分為極顯著負相關（<0.05），相關系數為?0.947，與滋味感官評價得分為顯著負相關（<0.01），相關系數為?0.849。

綜上，Ma中反式-橙花叔醇、2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、異物植醇、亞硫酸-2-乙基己基丁酯、6-氮雜雙環[3.2.1]辛烷的含量均顯著高于Mb（<0.05），推測這5個物質可能是常氧搖青條件下形成較優品質烏龍茶的標志性代謝物。

表4 不同搖青處理葉特征揮發性組分信息

表5 常氧搖青毛茶（Ma）和乏氧搖青毛茶（Mb）特征揮發性組分的相對含量

3 討 論

3.1 氣流因子差異介導的烏龍茶品質差異比較

做青車間通暢的氣流是形成烏龍茶優異品質的重要前提之一[12]。子筒a與子筒b間的氧氣含量差異顯著（<0.01），是造成Ta和Tb中茶樹HIG相關基因的差異表達的主要因素，而搖青處理是形成烏龍茶香氣品質的重要因子[23]，進而筒內氣流因子的間接影響了Ma和Mb的香氣組分構成。盡管Mb中所檢測獲得特征揮發性組分（17個）的揮發性物質數量多于Ma（7個），但通過感官品質的對比發現，常氧狀態下完成做青的Ma香氣清長、花香和“品種香”顯，優于乏氧狀態下的Mb。金心怡等對恒溫恒風和恒溫無風2種做青環境進行試驗比較發現，恒溫恒風調控方式能營造良好的做青環境，有利于毛茶優異品質的形成[12]，這與本研究的觀點一致。與此同時，該學者在研究中證實了，在氣流通暢的做青車間內，其空氣相對濕度較小，CO2濃度較低，在制青葉的呼吸速率維持在正常范圍內，有利于風味物質的形成與轉化，為優異品質奠定基礎[24]。由此推測，青葉經過乏氧搖青處理，密閉不通風，無法將代謝過程中的二氧化碳和水蒸氣排出，導致葉片含水量較高，而CO2濃度增加會抑制茶葉的呼吸作用，造成呼吸速率不規律，做青過程內含物質轉化不足，不利于茶葉形成優異品質，同時，氣流因子的缺乏或導致烏龍茶在制葉中形成和積累更多的揮發性代謝產物，以響應乏氧而引起的外源非生物脅迫，但值得注意的是，特征揮發物的數目與烏龍茶香氣和滋味品質間并無正向關聯（<0）。香氣是烏龍茶的靈魂，而揮發物是香氣形成的基礎[25]，因此，做青微環境流暢空氣所產生的烏龍茶揮發性組分濃度及其配比，或許更有利于烏龍茶優異香氣品質的形成。

3.2 氣流因子差異化做青形成的特征揮發性組分分析

做青工藝形成的揮發性組分是形成烏龍茶香氣品質的重要因子[26]。本試驗通過對氣流因子差異化做青毛茶中揮發性組分進行PLS分析，得到VIP最大的值（4.75）的香氣物質為吲哚，吲哚在烏龍茶“花香”中被認為是至關重要的香氣組分[27]，但差異分析發現，Ma與Mb中吲哚的含量并不存在顯著差異，吲哚主要在做青過程中搖青機械力的損傷脅迫下形成，這與Zeng等[28]的研究基本一致。作為重要的萜類化合物，羅勒烯（VIP=2.77）、法尼烯（VIP=3.06）、橙花叔醇（VIP=2.48）及反式-橙花叔醇（VIP=2.75）均是烏龍茶天然花果香的重要組分[29-30]，羅勒烯在Mb的含量要極顯著高于Ma（<0.05），反式-橙花叔醇則相反，而法尼烯和橙花叔醇的含量在Ma和Mb之間并無顯著差異（>0.05），這暗示了乏氧做青處理僅有利于羅勒烯及其異構體的形成，而不利于反-橙花叔醇的形成。作為茶葉中的另一大類香氣代謝源，脂肪族類香氣組分主要由長鏈不飽和脂肪酸經脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）途徑氧化降解而來，Zhou等[16]研究表明乏氧微環境（如筒內搖青）有利于C6醛類酶促還原反應的進行，形成并累積C6醇及其酯類；反之，常氧環境（水篩攤放）則有利于C6醛類非酶促氧化反應的進行，積累更多的C6酸及其酯類，在24種特征差異組分中，僅有己酸-3-己烯酯（VIP=1.84）一種，且在Ma和Mb之間差異并不顯著，這或許是因為本研究采用的是經過高溫烘干的毛茶，導致大量低沸點的揮發性脂肪酸類組分發揮和轉化。

4 結 論

本文利用氣相色譜-飛行時間質譜聯用（Gas Chromatography-Time-Of-Flight Mass Spectrometry，GC-TOF MS）技術結合多統計方法對常氧搖青毛茶和乏氧搖青毛茶揮發性成分進行檢測分析，鑒定了氣流因子差異化做青工藝的烏龍茶特征揮發性組分，得到如下結論：

1）在供試樣品總共鑒定出205種揮發性組分，結合最小偏二乘法篩選分析獲得24種特征揮發性組分，這些組分的重要性投影指標值均大于1.0。

2）常氧搖青條件制成的烏龍茶香氣品質表現為清長、優雅、花香較顯，其中以反式-橙花叔醇、2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、異植物醇、亞硫酸-2-乙基己基丁酯、6-氮雜雙環[3.2.1]辛烷為特征揮發性組分。

3）特征揮發性組分數量與烏龍茶香氣感官得分間為極顯著負相關（<0.01），相關系數為?0.947。

[1] Zeng L, Wang X, Liao Y, et al. Formation of and changes in phytohormone levels in response to stress during the manufacturing process of oolong tea ()[J]. Postharvest Biology and Technology, 2019, 157: 110974.

[2] Zhou Y, Zeng L, Hou X, et al. Low temperature synergistically promotes wounding-induced indole accumulation by inducer of CBF expression-mediated alterations of jasmonic acid signaling in[J]. Journal of Experimental Botany, 2020, 71(6): 2172-2185.

[3] 魏新林，王元鳳，王登良. 做青溫濕度對嶺頭單樅烏龍茶香氣成分的影響[J]. 無錫輕工大學學報，2002(3)：224-229.

Wei Xinlin, Wang Yuanfeng, Wang Dengliang. Effects of different green-making temperature & humidity on aromatic constituents in Lingtoudancong Oolong Tea[J]. Journal of Wuxi University of Light Industry, 2002(3): 224-229. (in Chinese with English abstract)

[4] 金心怡，郭雅玲，王秀萍，等. 做青間氣流因子對做青環境的影響[J]. 福建農業大學學報，2001(3)：362-367.

Jin Xinyi, Guo Yaling, Wang Xiuping, et al. Effects of airflow factors of fine manipulation room on air environment[J]. Journal of Fujian Agricultural University, 2001(3): 362-367. (in Chinese with English abstract)

[5] 郭雅玲，賴凌凌. 閩南烏龍茶加工工藝研究進展[J]. 熱帶作物學報，2012，33(6)：1142-1147.

Guo Yalin, Lai lingling. Researches advancement on the processes of Minnan Oolong Tea[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2012, 33(6): 1142-1147. (in Chinese with English abstract)

[6] 徐安安，黃亞輝. 近年烏龍茶做青工藝的發展研究[J]. 廣東茶業，2016(4)：23-27.

[7] 鄧慧莉，李鑫磊，毛貽帆，等. 不同做青溫度對烏龍茶滋味與香氣品質的影響[J]. 食品安全質量檢測學報，2021，12(14)：5766-5771.

Deng Huili, Li Xinlei, Mao Yifan, et al. Effect of different turning-over temperatures on the taste and aroma quality of Oolong tea[J]. Journal of Food Safety & Quality. 2021, 12(14): 5766-5771. (in Chinese with English abstract)

[8] 王芳, 陳倩蓮，陳百文，等. 做青過程中溫度對大紅袍茶主要滋味成分的影響[J]. 食品安全質量檢測學報，2022，13(2)：554-559.

Wang Fang, Chen Qianlian, Chen Baiwen, et al. Effects of temperature on the main taste components of Dahongpao tea during the green-making process[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2022, 13(2): 554-559. (in Chinese with English abstract)

[9] 陳林，陳鍵，陳泉賓，等. 做青工藝對烏龍茶香氣組成化學模式的影響[J]. 茶葉科學，2014，34(4)：387-395.

Chen Lin, Chen Jian, Chen Quanbin, et al. Effects of green-making technique on aroma pattern of Oolong Tea[J]. Journal of Tea Science, 2014, 34(4): 387-395. (in Chinese with English abstract)

[10] 劉寶順，占仕權，劉欣，等. 武夷巖茶制茶環境與品質[J]. 農產品加工，2016(21)：54-56.

Liu Baoshun, Zhan Shiquan, Liu Xin, et al. The environment and quality of Wuyi Rock Tea production[J]. Farm Products Processing, 2016(21): 54-56. (in Chinese with English abstract)

[11] 陳倩蓮，王芳，陳百文，等. 環境濕度對大紅袍做青品質的影響[J]. 食品安全質量檢測學報，2022，13(2)：593-598.

Chen Qianlian, Wang Fang, Chen Baiwen, et al. Effects of environmental humidity on the quality of Dahongpao during Zuoqing process[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2022, 13(2): 593-598. (in Chinese with English abstract)

[12] 金心怡，陳濟斌，王秀萍，等. 做青環境調控方式對烏龍茶品質影響的試驗研究[J]. 農業工程學報，2003，19(6)：215-218.

Jin Xinyi, Chen Jibin, Wang Xiuping, et al. Effect of controlling modes of Zuoqing conditions on quality of Oolong tea[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2003, 19(6): 215-218. (in Chinese with English abstract)

[13] 郝志龍，陳濟斌，金心怡，等. 烏龍茶振動做青設備研制與做青環境調控性能試驗[J]. 農業工程學報，2013，29(10)：269-277.

Hao Zhilong, Chen Jibin, Jin Xinyi, et al. Development and performance test of fine manipulation environment control for Oolong tea vibrating fine manipulation equipment[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2013, 29(10): 269-277. (in Chinese with English abstract)

[14] 王秀萍，金心怡，陳常頌，等. 不同氣流條件下做青過程青葉的呼吸作用[J]. 湖南農業大學學報（自然科學版），2008(1)：80-83.

Wang Xiuping, Jin Xinyi, Chen Changsong, et al. Studies on respiration of tea leaves during fine manipulation on different airflow condition[J]. Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences), 2008(1): 80-83. (in Chinese with English abstract)

[15] 郝志龍，林宏政，金心怡，等. 烏龍茶振動做青氣流和攤葉厚度對青葉做青物理特性的影響[J]. 福建農林大學學報（自然科學版），2017，46(2)：147-153.

Hao Zhilong, Lin Hongzheng, Jin Xinyi, et al. Effects of airflow and spreading thickness of tealeaf on physical characteristics of Oolong tea during vibrating fine manipulation[J]. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition), 2017, 46(2): 147-153. (in Chinese with English abstract)

[16] Zhou Z, Wu Q, Ni Z, et al. Metabolic flow of C6 volatile compounds from LOX-HPL pathway based on airflow during the post-harvest process of oolong tea[J]. Frontiers in Plant Science, 2021, 12: 738445.

[17] Si C, Liu H, Zhao X, et al. Non-targeted metabolomics analysis reveals dynamic changes of volatile and non-volatile metabolites during oolong tea manufacture[J]. Food Research International, 2020, 128: 108778.

[18] Zhou Z, Deng H, Wu Q, et al. Validation of reference genes for gene expression studies in post-harvest leaves of tea plant ()[J]. PeerJ, 2019, 7: e6385.

[19] Zhu J, Wang X, Guo L, et al. Characterization and alternative splicing profiles of lipoxygenase gene family in tea plant ()[J]. Plant & Cell Physiology, 2018(9): 9.

[20] GB/T 23776-2018, 茶葉感官審評方法[S]. 北京：中國標準出版社，2018.

[21] 滑金杰，王華杰，王近近，等. 采用PLS-DA分析毛火方式對工夫紅茶品質的影響[J]. 農業工程學報，2020，36(8)：260-270.

Hua Jinjie, Wang Huajie, Wang Jinjin, et al. Influences of first-drying methods on the quality of Congou black tea using partial least squares-discrimination analysis[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(8): 260-270. (in Chinese with English abstract)

[22] Zhou Z, Wu Q, Yang Y, et al. The dynamic change in fatty acids during the postharvest process of oolong tea production[J]. Molecules, 2022, 27(13): 4928.

[23] Zeng L, Zhou X, Su X, et al. Chinese oolong tea: An aromatic beverage produced under multiple stresses[J]. Trends in Food Science & Technology, 2020, 106: 242-253.

[24] 金心怡，王秀萍，吉克溫，等. 氣流對做青環境及烏龍茶品質形成的影響[J]. 茶葉科學，2003(1)：41-45.

Jin Xinyi, Wang Xiuping, Ji Kewen, et al. Effect of airflow on zuoqing environment and quality of oolong Tea[J]. Journal of Tea Science, 2003, 23(1): 41-45. (in Chinese with English abstract)

[25] 郭向陽，霍羽佳，王本友，等. 采用氣相色譜-離子遷移譜分析黃大茶加工過程揮發性成分[J]. 農業工程學報，2021，37(6)：274-281.

Guo Xiangyang, Huo Yujia, Wang Benyou, et al. Analysis of volatile compounds in large-leaf yellow tea during manufacturing processes using gas chromatography-ion mobility spectrometry[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(6): 274-281. (in Chinese with English abstract)

[26] 周子維，游芳寧，劉彬彬，等. 搖青機械力對烏龍茶脂肪族類香氣形成的影響[J]. 食品科學，2019，40(13)：52-59.

Zhou Ziwei, You Fangning, Liu Binbin, et al. Effect of mechanical force during turning-over on the formation of aliphatic aroma in oolong tea[J]. Food Science, 2019, 40(13): 52-59. (in Chinese with English abstract)

[27] Zeng L, Jin S, Xu Y, et al. Exogenous stimulation-induced biosynthesis of volatile compounds: Aroma formation of oolong tea at postharvest stage[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2022, 106: 242-253.

[28] Zeng L, Zhou Y, Gui J, et al. Formation of volatile tea constituent indole during the oolong tea manufacturing process[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016, 64(24): 5011-5019.

[29] Chen S, Xie P, Li Y, et al. New insights into stress-induced-ocimene biosynthesis in tea () leaves during oolong tea processing[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69(39): 11656-11664.

[30] He C, Li Y, Zhou J, et al. Study on the suitability of tea cultivars for processing oolong tea from the perspective of aroma based on olfactory sensory, electronic nose, and GC-MS data correlation analysis[J]. Foods, 2022, 11(18): 2880.

Effects of differential green-making by airflow factors on the aroma quality of oolong tea

Zhou Ziwei1,2, Wei Yingying1, Wu Qingyang2, Fan Lijun1, Rao Hongting1, Chen Yuanyuan1, Wu Lingzhen1, Dai Binbin1, Cai Liewei1, Zheng Shizhong1, Wang Fang1, Sun Yun2※

(1./,,352100,; 2.,,350002,; 3.,,350002,)

Oolong tea is one of the six major Chinese traditional tea categories, due to its naturally fruity and floral aroma. Unlike green and black tea, the quality of oolong tea is originated from the processing (named green-making), which also contributes to the semi-fermentation degree. The green-making includes turnover and indoor withering. The former refers to shaking the solar-withered tea leaves several times, while the latter is to pause for hours after turnover. The two steps are repeated alternately during the manufacturing process of oolong tea. Therefore, all process parameters can pose some influences on the aroma of oolong tea, such as the mode of green-making, the intensity of turnover, indoor withering, and the thickness of spread tea leaves. In addition, the environmental factors of green-making also play an important role in the formation of oolong tea quality, including environmental temperature, humidity, and atmosphere. The airflow is the carrier of temperature and humidity, particularly the indispensable determiner of oolong tea quality. However, it is still lacking in the effects of airflow on the oolong tea green-making during tea processing. This study aims to explore the effect of the airflow factor on the aroma quality of oolong tea during the process of green-making. The test materials were selected as fresh tea leaves (CK), normoxic tea leaves (Ta), hypoxic tea leaves (Tb), and their associated raw tea a (Ma) and raw tea b (Mb). The volatile components of oolong tea mediated by different airflow factors were analyzed by multivariate statistical analysis after the semi-quantitative Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), headspace solid-phase microextraction (HS-SPME), and Gas Chromatography Time-of-Flight Mass Spectrometry (GC-TOF MS). The result showed that both green-making rollers (named subroller a and subroller b) fully met the conditions of normoxia and hypoxia. The relative expression levels of hypoxic stress response factorsgene andgene in Tb were up-regulated founded on the brightness of electrophoresis bands compared with the Ta and CK. 205 volatile components were identified in the raw tea. 33 kinds of shared differential metabolites were found among the CK, Ta and Tb, most of which were alcohol (8 kinds) and alkene (7 kinds). Partial Least Squares (PLS) analysis showed that there were 24 characteristic aroma components, whose Variable Important Projection (VIP) values were more than 1.0. Among them, the VIP value of indole was the largest (4.75), followed by-farnesene (3.06), ocimene mixture of isomers (2.77), and trans-nerolidol (2.75). The analysis of variance showed that there were five characteristic aroma components in the Mb, whereas, only two in the Ma. The sensory evaluation of raw tea indicated that the aroma of Ma was clean, lasting and refreshing, indicating a distinct flowery scent, achieved the final score 90.67. More importantly, the final score was achieved in 90. By contrast, the aroma of the Mb was dull, less pleasant, lack of long and clean, particularly with the floral and characteristics variety fragrance. The contents of five volatiles in the Ma were extremely significantly higher than those in the Mb (<0.05), including the trans-nerolidol, 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4(H)-pyran-4-one, isophytol, 2-ethylhexyl butyl sulfite, 6-azabicyclo [3.2.1] octane. It infers that these five substances can be the landmark metabolites to form better quality oolong tea under the normoxic turn-over condition. This finding can provide a strong reference to better understand the effect of airflow factors on the metabolism of aroma substances during the green-making process. A theoretical foundation was also laid to explore the formation mechanism of aroma quality during the green-making process of oolong tea mediated by environmental factors.

flavors; quality control; oolong tea; airflow; green-making; volatile components; partial least squares

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.21.028

TS207.3

A

1002-6819(2022)-21-0240-09

周子維，魏瑩瑩，吳晴陽，等. 氣流因子差異化做青工藝對烏龍茶香氣品質的影響[J]. 農業工程學報，2022，38(21)：240-248.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.21.028 http://www.tcsae.org

Zhou Ziwei, Wei Yingying, Wu Qingyang, et al. Effects of differential green-making by airflow factors on the aroma quality of oolong tea[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(21): 240-248. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.21.028 http://www.tcsae.org

2022-07-27

2022-09-19

福建省自然科學基金項目（2021J05271）；寧德師范學院人才項目（2022Y05）；財政部和農業農村部：國家現代農業（茶葉）產業技術體系建設專項（CARS-19）

周子維，博士，講師，研究方向茶葉加工與加工工程。Email：zwchow92@126.com

孫云，博士，教授，博士生導師，研究方向茶葉加工與品質。Email：sunyun1125@126.com