蛇床子催眠活性組分對PCPA失眠大鼠松果體細胞凋亡和相關Bcl-2/Bax蛋白表達的影響

郭晉良，楊鈐，王若瑜，宋美卿，賈力莉，牛艷艷，仝立國，馮瑪莉

(山西省中醫藥研究院，山西 太原 030012)

松果體(Pineal gland，PG)被認為是晝夜節律的神經內分泌轉換器，以高度晝夜節律的方式產生褪黑激素(Melatonin，MT)，傳播晝夜節律的信息[1]。褪黑素作為松果體的主要分泌產物，除了具有鎮靜、調整生物鐘外，還有強大的清除氧自由基和抗氧化功能、保護膜脂質、線粒體免受氧化損傷，維持神經膠質細胞功能等作用[2-3]。當松果體結構功能損傷后，會影響褪黑素分泌引發一系列生理紊亂。目前研究認為，松果體組織結構損傷與細胞凋亡關系密切，細胞凋亡導致細胞可控性自我滅亡，當細胞開始受損或不再被機體需要時，會發生凋亡或稱程序性細胞死亡，為機體生理過程[4]，因此松果體細胞凋亡可能是導致松果體組織發生不可逆損傷的重要原因，而細胞凋亡由多種凋亡基因調控，其中對Bcl-2、Bax的研究調控線粒體凋亡途徑的重要蛋白[5]。

前期研究發現PCPA制備失眠大鼠導致松果體細胞排列、細胞結構改變，具有顯著催眠作用的蛇床子催眠活性組分對PCPA失眠大鼠致松果體結功能損傷具有改善作用[6-7]。本研究在前期基礎上，觀測CHC對松果體組織細胞凋亡密切相關的Bcl-2、Bax蛋白表達的影響，基于線粒體介導的細胞凋亡途徑，探討CHC改善PCPA失眠大鼠松果體損傷作用靶點，以期從蛇床子催眠活性成分中發現保護松果體有效成分及其機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠，雄性，4～6月齡，購買自北京華阜康生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0008，合格證號：110322011006905，置恒定溫度(22～24 ℃)與濕度(40%～50%)的實驗環境中，自由飲水、攝食飼料。

1.2 藥品與試劑

CHC制備：蛇床子600 g粉碎成粗粉，加95%的乙醇加熱回流提取，濾過，干燥，浸膏，通過D101大孔吸附樹脂柱層析，30%～95%濃度乙醇梯度洗脫，收集60%乙醇洗脫液，減壓濃縮干燥，得20.5 g，每克折合蛇床子29 g，使用時以2 %吐溫80配制成不同濃度的混懸液；褪黑素(北京Solarbio公司，批號：917D021)。Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物公司，批號：20190730)；TUNEL試劑盒(碧云天，批號：011420200717)；Bcl-2多克隆抗體(abcam公司，批號：CR249198-76)；Bax多克隆抗體(CST公司，批號：9662S)。

1.3 儀器

Navios 10流式細胞儀(美國 Beckman Coulter 公司)；Heated自動染色機(美國Thermo Fisher公司)；Shandon Clearvue自動封片機(美國Thermo Fisher公司)；BX51+DPT2+IPE萬能顯微鏡熒光成像系統(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 模型制備與分組

大鼠適應性喂養7 d，隨機分為空白對照組、模型對照組、MT陽性對照(10 mg/kg)組、CHC高、中、低劑量(60、30、15 mg/kg)組，每組10只。參考PCPA混懸液配制方法[3]改良如下：用時以2%吐溫-80配制碳酸鹽(碳酸鈉/碳酸氫鈉)緩沖液(pH 10.1)，配成4.5% PCPA混懸液。除空白對照組給予等量含2%吐溫的碳酸鹽緩沖液，其余各組大鼠腹腔注射PCPA混懸液0.45 g/kg，每天1次，連續2 d。造模各組大鼠晝夜節律消失，出現皮毛枯槁戰栗且易脫落等外觀改變，直立、洗臉、走動等次數變多，興奮性增高，易驚嚇，易激惹，易攻擊撕咬，表明模型復制成功。各給藥組灌胃給藥，空白對照組、模型對照組灌胃等體積2%吐溫-80，每天1次，連續7 d。

2.2 指標檢測

2.2.1 記錄體質量

在造模前、造模后灌胃前、灌胃后3個時間節點稱量各組大鼠體質量。

2.2.2 松果體組織病理學觀察

末次給藥30 min后，剖取松果體，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋HE染色，顯微鏡下觀察組織形態學變化。

2.2.3 TUNEL凋亡指數檢測

取松果體組織切片，經脫蠟、脫水后，采用TUNEL法檢測細胞凋亡，具體操作按試劑盒說明書進行。高倍鏡(×400)顯微鏡觀察細胞核呈棕褐色為陽性細胞，計算松果體細胞凋亡指數，以凋亡指數反映各組松果體凋亡的情況，凋亡指數(Allgroups’apoptosisindex,AI)=視野內凋亡細胞個數/視野內所有松果體細胞個數。

2.2.4 流式細胞術檢測松果體凋亡

同上法剖取松果體，PBS(pH7.2、0.01 mol/L)清洗，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃、20 min，加胎牛血清終止消化，過濾，去除結締組織，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用Binding緩沖液調細胞懸液至細胞濃度為5×106/mL，取細胞懸液100 μL，加AnnexinV-FITC及Propidium Iodide各5 μL，避光孵育15 min，加Binding緩沖液0.5 mL，上機檢測。

2.2.5 免疫組化檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達

按中杉金橋兔二步法檢測試劑盒說明書操作，Bcl-2、Bax稀釋度分別為1∶200及1∶100，DAB顯色，陽性表達細胞被染成棕黃色，顯微鏡觀察并拍片。用Image pro plus 6.0進行分析，以積分吸光度和陽性染色面積比值表示蛋白的相對表達量。

2.3 統計學分析

3 結果

3.1 體質量變化

體質量變化：對造模前、造模后給藥前、給藥后3個時間節點的大鼠體質量進行分析，與空白對照組比較，造模前各組大鼠體質量并沒有差別、較穩定，具有可比性；腹腔注射PCPA混懸液后造模各組大鼠體質量呈下降趨勢，模型對照組顯著低于空白對照組(P<0.01)；給藥后模型對照組顯著低于空白對照組(P<0.01)，CHC高、CHC中劑量組顯著高于模型對照組(P<0.01，P<0.05)，給藥各組的體質量均數介于PCPA模型與空白對照組之間，見表1。

表1 各組大鼠體質量變化情況

3.2 各組大鼠病理組織學變化

空白對照組松果體細胞排列緊密，細胞核呈圓形，可見明顯的核仁并有較深的著色，胞質由于弱嗜堿性而染色較淺，胞膜完整；膠質細胞呈梭形或星形少數，形態規則，核仁清晰，整體無明顯細胞損傷表現。模型對照組的松果體細胞數目明顯減少，細胞界限模糊，細胞體積萎縮變小，排列紊亂疏松，無明顯規律，胞質內存在較多大小不一的脂滴，空泡變性明顯增多，細胞核固縮向周邊移動，出現少量凋亡小體，膠質細胞減少。MT組松果體細胞紊亂排列，數目減少，空泡變性增多，細胞界限模糊不清。CHC高、CHC中劑量組的松果體細胞排列輕度紊亂，核固縮，CHC高劑量組的松果體細胞形態恢復效果最好。CHC低劑量組與模型對照組無明顯差別，見圖1。

圖1 各組大鼠松果體病理組織學變化(HE，×400)

3.3 各組大鼠松果體細胞凋亡情況

3.3.1 TUNEL松果體AI指數

模型對照組AI指數顯著高于空白對照(P<0.01)；MT組、CHC高、中劑量組AI指數顯著低于模型對照組(P<0.01)，見表2。

3.3.2 各組大鼠松果體早期凋亡率

模型對照組大鼠松果體細胞早期凋亡率顯著高于空白對照組(P<0.05)；CHC高劑量組早期凋亡率顯著低于模型對照組(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠松果體凋亡指數、早期凋亡率的比較

3.4 各組大鼠對松果體Bax、Bcl-2表達的影響

與空白對照組比較，模型對照組Bcl-2陽性表達明顯下降(P<0.05)，與模型組比較，MT組、CHC高、中劑量組Bcl-2蛋白表達升高(P<0.01，P<0.05)；與空白對照組比較，模型對照組Bax陽性表達顯著升高(P<0.01)，與模型組比較，MT組、CHC高、中劑量組Bax蛋白表達明顯下降(P<0.05，P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠松果體Bcl-2、Bax表達情況

4 討論

PCPA是一種作用于5-HT生物合成中的色氨酸羥化酶的不可逆抑制劑，阻斷5-HT合成，常用于建立大鼠失眠模型，為制備失眠模型的經典方法[8]。課題組前期在模型評價時光鏡、電鏡下觀察松果體組織出現明顯病理改變，證實腹腔注射PCPA損傷大鼠松果體結構，本實驗以2%吐溫-80增加PCPA溶解，為PCPA制備失眠造模提供更有效的方法。腹腔注射PCPA混懸液誘發大鼠松果體損傷及凋亡的機制尚不清楚，未見PCPA化學毒性、神經毒性或損傷組織細胞的相關報道。文獻提示長期清醒狀態下大腦更易受氧化應激的影響，由于腦組織不飽和脂肪酸及蛋白質含量較高，代謝旺更易氧化和產生自由基，細胞、組織更易受損[9-11]，PCPA注射后大鼠持續清醒狀態可能是松果體受到損傷的一部分原因。本次實驗病理切片顯示,PCPA造模組細胞周圍間隙增寬，細胞數目減少且形態不完整，胞體變小，胞核變形不規則，空泡變性增多，CHC中、高劑量組大鼠松果體細胞數量、排列規則、形態均接近正常大鼠，再次驗證腹腔注射PCPA對松果體結構功能造成一定的破壞，CHC可不同程度改善松果體損傷。

目前在PCPA大鼠模型中關于體質量變化的相關統計，結果基本一致，相關實驗證明大鼠注射PCPA后體質量延緩增長或降低，但有關體質量減低的明顯差異節點不同。有部分實驗研究提示PCPA注射2 d后體質量迅速下降，與空白對照組比較差異十分顯著[12-13]。本次結果顯示，造模前各組大鼠體質量與空白對照組比較無差別，各組大鼠的體質量相對穩定，具有可比性；腹腔注射PCPA 2 d對大鼠體質量產生影響，造模后大鼠體質量明顯下降，隨7 d灌胃給藥，各組大鼠體質量緩慢增長，CHC中、高劑量組體質量得到改善，說明CHC可緩解PCPA失眠大鼠體質量下降的趨勢。

細胞凋亡是由相關基因經過特定的調控程序、參與細胞生理性死亡的過程。目前已報道有數十種基因調控著細胞凋亡過程。比如按照功能區分為能夠抑制凋亡基因的IAP、Bcl-2、EIB等作為一類,能夠促進凋亡基因的Fas、Bid、Bax、P53等作為一類。還有能夠雙向調控基因比如Bcl-x、C-mye等[14-15]。在這3類相關調控基因中，Bcl-2是目前被認識第一個識別為能夠抑制細胞凋亡的特定基因，相關研究指出基因Bcl-2能夠抵抗其凋亡機制的主要原因有直接性的抗氧化、抑制細胞中調節蛋白Bak、Bax的促凋亡的細胞毒作用、牽制在線粒體中釋放加速凋亡的相關蛋白質比如凋亡誘導因子(AIF)和細胞色素C、以及阻止凋亡蛋白酶激活、維持相關細胞鈣的穩態[16-17]。其中Bcl-2/Bax是能夠抑凋亡和促細胞凋亡的特定基因表達的蛋白。兩對功能相反的基因關系極為密切，因為兩個基因的表達能夠平衡，這決定著相關細胞存活和特定細胞的死亡[18]。

本次實驗研究中應用TUNELAI指數及流式觀察早期細胞凋亡的計算發現，說明PCPA模型組大鼠顯著增加了松果體細胞凋亡，MT組同CHC中、高劑量組均能抑制松果體細胞凋亡，證實了CHC對松果體保護作用的實驗驗證。實驗結果同時顯示，模型對照組松果體Bcl-2蛋白表達下降，但Bax蛋白表達增加明顯。通過給予CHC之后，Bcl-2的表達會明顯升高，但Bax 表達會降低明顯，提示CHC通過協調Bcl-2/Bax的平衡對PCPA失眠大鼠細胞凋亡進行改善與保護。如果能夠對CHC的凋亡機制做更充分和深入的了解，更全面去認識CHC，它可能會成為一個潛在的治療松果體損傷并且能夠改善睡眠的新藥，為失眠患者帶來福音。