天香丹對人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護作用研究

辛錦鈺，張亞潔，古麗葛娜·薩吾爾，何歡，任珊，安冬青

(新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院 新疆名醫(yī)名方與特色方劑學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011)

1 材料與方法

1.1 藥品

天香丹顆粒(新疆華世丹藥業(yè)有限公司，批號：新藥制字Z20040820)；維生素C(北京索萊寶科技有限公司，批號：A8100)；tBHP(上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn)，批號：B802372)。

1.2 細胞株

人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVECs，購于上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 試劑

內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基購于美國ScienCell公司；胎牛血清、胰酶和雙抗均購于美國Gibco公司；PBS購于美國Hyclone公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購于北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒和微量還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號依次為：A001-3-2、A020-2、A006-2-1)；活性氧檢測試劑盒及細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒則購于碧云天生物技術(shù)有限公司(批號依次為：S0033、C0003)。

1.4 儀器

多功能酶標儀(美國Thermo公司)，低溫高速離心機(德國Eppendrof公司)。

1.5 方法

1.5.1 HUVECs細胞培養(yǎng)

用含有10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素-鏈霉素)和1%內(nèi)皮細胞生長因子的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，每2～3 d傳代1次，取處于對數(shù)生長期的活躍細胞進行實驗。

1.5.2 tBHP誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激損傷模型的建立

合同簽訂后，按照誰承辦誰負責的原則，由合同承辦部門負責合同的實際履行，在履行中因我方過錯引發(fā)法律糾紛，給公司造成經(jīng)濟損失的，應(yīng)追究承辦部門或相關(guān)人員的責任。合同歸口管理部門負責各部門合同履行的監(jiān)督、檢查與考核，并每半年定期對各部門合同履行情況進行清查通報。

待培養(yǎng)瓶中細胞長至80%～90%時，用胰蛋白酶進行消化后離心,用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液重懸細胞，接種于96孔板中，使每孔細胞數(shù)為1.5×104個，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度tBHP的無血清培養(yǎng)液，藥物濃度分別為60 μmol/L、120 μmol/L、180 μmol/L、240 μmol/L，并設(shè)置對照組和空白組，其中對照組含有細胞和培養(yǎng)液，空白組只有培養(yǎng)液。作用24 h后各孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄去上清，再加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液，使藍紫色甲臜充分溶解，酶標儀492 nm波長處測各孔吸光度A值，計算細胞存活率,實驗重復(fù)3次。細胞存活率(%)=[(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%。

1.5.3 天香丹對tBHP誘導(dǎo)的HUVECs存活率的影響

將細胞分為對照組、模型組、陽性對照藥組和天香丹低、中、高劑量組，按每孔1.5×104個將細胞接種于96孔板中，待貼壁后棄去培養(yǎng)液。對照組和模型組均加入無血清培養(yǎng)液，天香丹組加入含不同濃度天香丹的無血清培養(yǎng)液，其濃度分別為30 μg/mL、60 μg/mL、90 μg/mL，陽性對照藥組為50 μg/mL維生素C組，預(yù)處理12 h。棄去培養(yǎng)液，隨后加入240 μmol/L tBHP作用24 h。各孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄上清，再加入150 μL DMSO溶液使藍紫色甲臜溶解，于酶標儀492 nm波長處測各孔A值，計算細胞存活率，實驗重復(fù)3次。

1.5.4 細胞中LDH、SOD、GSH含量的測定

按每孔3.0×105個將細胞均勻接種于6孔板中，密切關(guān)注細胞生長狀態(tài)，待細胞生長至80%～90%時棄去舊培養(yǎng)液，將細胞分為對照孔、模型孔、陽性對照藥孔和天香丹低、中、高劑量孔，其中對照孔及模型孔加入2 mL無血清培養(yǎng)液，陽性對照藥孔加等體積50 μg/mL的維生素C，天香丹孔則各加入等體積濃度依次為30 μg/mL、60 μg/mL、90 μg/mL的天香丹培養(yǎng)液，預(yù)處理12 h后棄去培養(yǎng)液，加入240 μmol/L tBHP作用24h，誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激后收集各組細胞，嚴格按照試劑盒說明書操作并測定各組細胞中LDH、SOD和GSH的含量，實驗重復(fù)3次。

1.5.5 天香丹對tBHP誘導(dǎo)的HUVECs形態(tài)學的影響

按每孔3.0×105個將細胞均勻接種于6孔板中。待細胞密度達80%～90% 時棄去培養(yǎng)液，并按1.5.4方法給予細胞不同處理，后棄去舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液，將細胞置于倒置顯微鏡下觀察各組形態(tài)學差異，并保存圖像。

1.5.6 Hoechst 33258熒光染色法檢測天香丹對細胞凋亡的影響

制備細胞爬片，并按1.5.4方法給予細胞不同處理，后棄去培養(yǎng)液，潤洗細胞并加入固定液固定20 min，棄去固定液，PBS洗滌固定液3次，每次3～5 min。隨后按每孔500 μL加入Hoechst 33258染色液染色5 min，清洗染色液3次，期間將抗熒光淬滅封片液滴加在載玻片上，待染色液清洗完全將貼有細胞的玻片翻蓋于載玻片上，確保細胞與封片液緊密接觸，將細胞置于熒光顯微鏡下觀察并隨機選擇3個視野進行細胞計數(shù)。計數(shù)100個細胞中凋亡所占細胞個數(shù)，計算凋亡率,實驗重復(fù)3次，取3次計數(shù)結(jié)果的平均值。凋亡率(%)=(凋亡細胞數(shù)/100)×100%。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度tBHP對HUVECs存活率的影響

采用MTT法測定不同濃度tBHP對人臍靜脈內(nèi)皮細胞存活率的影響。結(jié)果如表1所示，與對照組相比，細胞存活率與tBHP濃度呈負相關(guān)，120 μmol/L、180 μmol/L和240 μmol/L tBHP作用24 h后，能顯著降低細胞存活率，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中240 μmol/L tBHP濃度細胞存活率為(50.79±0.53)%，接近50%，為建立氧化應(yīng)激模型的最佳作用濃度。

表1 不同濃度tBHP對HUVECs存活率的影響

2.2 天香丹對tBHP誘導(dǎo)的HUVECs存活率的影響

MTT法評價天香丹對tBHP誘導(dǎo)的HUVECs存活率的影響，結(jié)果如表2所示，模型組細胞存活率為(49.34±2.45)%，與對照組相比明顯降低(P<0.05)；相較于模型組，陽性對照組和不同濃度天香丹預(yù)處理組的細胞存活率均有明顯升高(P<0.05)，表明天香丹對tBHP誘導(dǎo)的HUVECs氧化損傷具有抑制作用。

表2 不同濃度天香丹對tBHP誘導(dǎo)的HUVECs存活率的影響

2.3 天香丹對tBHP誘導(dǎo)的HUVECs細胞內(nèi)LDH活性、SOD活力和GSH含量的影響

結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)tBHP誘導(dǎo)損傷后，細胞LDH的釋放量顯著上升(P<0.01)，SOD的活性和GSH的含量顯著下降(P<0.01)；與模型組相較，陽性藥組和天香丹預(yù)處理組LDH釋放量明顯下降，SOD的活性和GSH含量明顯上升，如表3所示。

表3 不同濃度天香丹對tBHP誘導(dǎo)的HUVECs細胞內(nèi)LDH的活性、SOD活力和GSH含量的影響

2.4 天香丹對tBHP誘導(dǎo)的HUVECs形態(tài)學的影響

顯微鏡下觀察結(jié)果如圖1所示，模型組細胞在tBHP刺激下或皺縮或細胞破碎，同時因氧化應(yīng)激導(dǎo)致膜蛋白活性改變等因素，細胞貼壁不良，漂浮細胞較多；陽性對照組和天香丹低劑量組與模型組相比稍有好轉(zhuǎn)，皺縮細胞減少，貼壁細胞數(shù)量增加但形態(tài)較差；天香丹中劑量組和高劑量組較模型組差異則更為明顯，漂浮細胞明顯減少，貼壁細胞數(shù)量較多，尤以高劑量組為最，形態(tài)呈梭形或多邊形，彼此嵌合。提示維生素C和低、中、高劑量天香丹預(yù)處理后，均能有效改善tBHP誘導(dǎo)的HUVECs細胞形態(tài)損傷。

注：A.對照組；B.模型組；C.陽性對照組；D.天香丹低劑量組；E.天香丹中劑量組；F.天香丹高劑量組。

2.5 Hoechst 33258熒光染色法檢測天香丹對tBHP誘導(dǎo)的HUVECs細胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下，染色結(jié)果如圖2所示：對照組細胞核形態(tài)多為光滑圓形或橢圓形，核著色程度均一且熒光強度較低，對應(yīng)細胞凋亡率維持在低水平(3.35±0.57)%；經(jīng)tBHP誘導(dǎo)損傷后，細胞貼壁不良，視野范圍內(nèi)細胞數(shù)量明顯減少，細胞核形態(tài)由橢圓形轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則形，甚至出現(xiàn)核泄漏，胞核也因染色質(zhì)固縮而出現(xiàn)致密濃染，熒光由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{白色甚或亮白色，經(jīng)計算，凋亡率達到(40.62±1.78)%，較對照組明顯上升；陽性對照藥及天香丹預(yù)處理后，細胞核形態(tài)由不規(guī)則形逐漸轉(zhuǎn)為橢圓形，細胞凋亡受到不同程度的抑制，凋亡率分別降至(27.26±1.48)%、(27.43±1.44)%、(10.08±1.52)%、(5.08±1.06)%，與模型組相比差異明顯(P<0.01)。

注：A.對照組；B.模型組；C.陽性對照組；D.天香丹低劑量組；E.天香丹中劑量組；F.天香丹高劑量組。

3 討論

冠狀動脈微循環(huán)是指由直徑300 μm以內(nèi)的微血管組成的供心臟血液流通的循環(huán)網(wǎng)，通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮剪切應(yīng)力、血管舒縮和物質(zhì)運輸來保證局部血流與組織代謝供需相匹配[4]。研究顯示，當微循環(huán)發(fā)生結(jié)構(gòu)或功能性障礙時，供需失衡會干擾心肌血流量的調(diào)控，對冠心病患者心肌灌注造成不利影響[5]。CMD的形成原因多樣，內(nèi)皮功能障礙是其中的主要因素之一，其特征是氧化應(yīng)激增加，NO生物利用度逐漸降低，進一步導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。

氧化應(yīng)激是機體在遭受刺激時，體內(nèi)自由基成分包括活性氧(ROS)和活性氮(RNS)產(chǎn)生過多，氧化與抗氧化系統(tǒng)之間平衡失調(diào)的適應(yīng)性反應(yīng)。生理狀態(tài)下，一定濃度的氧自由基參與細胞的氧化還原調(diào)節(jié)和正常代謝功能，如促有絲分裂反應(yīng)和細胞因子的產(chǎn)生等，過量則可通過酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)清除[2]。在冠心病心肌缺血缺氧等病理因素作用下，細胞ROS生成增加，高濃度ROS可對蛋白質(zhì)和DNA進行不利修飾，引起生物活性改變，功能喪失，同時也可通過脂質(zhì)過氧化作用破壞細胞膜完整性，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)重排[6]。乳酸脫氫酶(LDH)是細胞損傷的判斷指標，其水平反應(yīng)了細胞膜受損程度；超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)是機體重要的內(nèi)源性抗氧化因子，前者通過歧化方式將超氧化物轉(zhuǎn)化為H2O2，再經(jīng)由后者轉(zhuǎn)化為氧和水，從而發(fā)揮清除氧自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷的作用[7]。tBHP是常見的體外氧化應(yīng)激模型誘導(dǎo)劑，可引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)并損傷DNA，從而導(dǎo)致細胞損傷甚或凋亡，相較H2O2具有穩(wěn)定，不易分解的優(yōu)點[8-9]，因此本研究采用tBHP作為誘導(dǎo)劑建立細胞氧化應(yīng)激損傷模型。研究結(jié)果顯示，HUVECs經(jīng)240 μmol/L tBHP作用24 h后，LDH釋放量顯著升高，而SOD的活性及GSH含量明顯降低，表明tBHP可有效誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。

根據(jù)冠脈微循環(huán)障礙的臨床特點，中醫(yī)將其歸為“胸痹”“脈痹”的范疇，治宜益氣活血、化瘀通絡(luò)[10]。天香丹由新塔花、丹參、降香和紅景天4味中藥配伍而成，既有益氣補虛之功，又奏和血通絡(luò)之效，可顯著改善冠心病患者心肌缺血缺氧癥狀。既往研究顯示，天香丹主藥新塔花總黃酮具有舒張血管、抗氧化應(yīng)激、保護血管內(nèi)皮細胞的作用[11-12]；降香可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)改善后負荷增加型心衰大鼠的心臟功能，提高心肌細胞存活率，其中的新黃酮成分還對缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的細胞損傷具有明顯保護作用[13-14]。而本實驗對受損細胞存活率和細胞中LDH、SOD、GSH的檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過不同濃度天香丹及天然抗氧化劑維生素C預(yù)處理后，細胞存活率逐漸上升，SOD的活性和GSH含量較模型組提升明顯，LDH釋放量也有所減輕。提示我們，天香丹能通過增強細胞自由基清除力，有效遏制外源性氧化劑對HUVECs的損傷。

細胞凋亡是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種程序性死亡方式，也是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，影響內(nèi)皮功能的病理環(huán)節(jié)之一，氧化應(yīng)激是其重要誘導(dǎo)因素：一方面細胞內(nèi)ROS堆積可誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔開放，通過破壞細胞膜電位介導(dǎo)細胞凋亡，另一方面ROS也可通過上調(diào)p53及p66shc的表達,引起DNA損傷進而導(dǎo)致細胞凋亡[15-16]。細胞凋亡的發(fā)生并非朝發(fā)夕至，通過有效干預(yù)手段仍有部分逆轉(zhuǎn)細胞凋亡，保護細胞免于過度損傷的可能。Hoechst 33258是一種脫氧核糖核酸粘合劑，可與DNA相互結(jié)合，是目前常用細胞凋亡檢測方法[17]。本研究對細胞核染色結(jié)果顯示，240 μmol/L tBHP作用24 h能明顯誘導(dǎo)細胞凋亡，引起染色質(zhì)固縮及核泄漏，而經(jīng)過維生素C及天香丹預(yù)處理后細胞凋亡率逐漸下降，天香丹高劑量組凋亡率與對照組相比更無明顯差異(P>0.05)，提示天香丹能部分逆轉(zhuǎn)細胞凋亡，且這種抑制凋亡的作用在一定范圍內(nèi)與濃度呈正相關(guān)。

綜上所述，天香丹能保護內(nèi)皮細胞免于氧化損傷，而這種保護作用可能與抗氧化通路的激活，自由基清除力的增強及細胞凋亡的部分逆轉(zhuǎn)有關(guān)。該實驗為天香丹在CMD的預(yù)防和治療提供了一定的科學依據(jù)，但天香丹對HUVECs保護作用的分子機制仍待進一步闡明。