基質金屬蛋白酶類水平與抗結核藥物性導致肝損傷的相關性分析

陸霓虹 沈凌筠 劉洪璐 陳楊君 杜映榮

抗結核藥物導致的肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATB-DILI)在臨床中的發生率約為8%～10%；因ATB-DILI導致的結核病患者停藥比例占臨床患者的5%～10%，導致結核病耐藥風險升高[1]；同時，ATB-DILI 的發生也會進一步加重患者的治療負擔[2]。ATB-DILI的發生機制及影響因素尚未明確。基質金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMP)是一組與鋅結合的、分解胞外基質的蛋白酶，參與胚胎正常發育及組織重塑，并在多種病理過程中發揮作用，如炎癥反應、類風濕關節炎、惡性腫瘤浸潤、動脈粥樣硬化、腦血管病和多發性硬化等[3]。有文獻報道MMP與肝纖維化有相關性[4]，但是否與藥物性肝損傷有相關性，目前未見報道。為此，筆者選取ATB-DILI患者作為研究對象，檢測其MMP水平，嘗試探究MMP與ATB-DILI的相關性，以為預防及治療ATB-DILI尋找新的研究方向。

對象和方法

1.研究對象：采用回顧性研究方法，收集2019年6月至2020年6月昆明市第三人民醫院收治的肺結核患者中發生ATB-DILI的98例患者作為病例組，其中，男61例(62.2%)，女37例(37.8%)；年齡范圍為18～57歲，年齡中位數(四分位數)為29.2(18.4，56.6)歲。選取同期門診健康體檢者30名作為對照組，其中，男19名(63.3%)，女11名(36.7%)，年齡范圍為18～43歲，年齡中位數(四分位數)為27.5(20.5，42.9)歲。本研究經昆明市第三人民醫院倫理委員會審核批準(201902313)，所有研究對象均經知情同意。

2.診斷標準：(1)ATB-DILI診斷：患者使用2H-R-Z-E/4H-R(H：異煙肼；R：利福平；Z：吡嗪酰胺；E：乙胺丁醇)抗結核治療方案，在抗結核治療過程中出現肝損傷，肝損傷與抗結核藥物的使用直接相關。診斷標準參照《抗結核藥物性肝損傷診治指南(2019年版)》[5]；(2)肺結核診斷：參照《WS 288—2017 肺結核診斷》[6]。

3.排除標準：(1)乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝炎等患者；(2)患有導致免疫功能低下疾病(如腫瘤、糖尿病等)的患者；(3)接受免疫調節治療(包括激素、免疫抑制劑等)者；(4)患有其他導致肝損傷相關疾病者。

4.ATB-DILI臨床分型：根據《抗結核藥物性肝損傷診治指南(2019年版)》進行分型[5]。(1)肝細胞損傷型(A組)：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)>3倍正常上限(ULN)，且R值[(ALT的實測值/ALT的ULN)/(ALP的實測值/ALP的ULN)]≥5；(2)膽汁淤積型(B組)：堿性磷酸酶(ALP)>2倍ULN，且R值≤2，血清ALP水平升高，且先于ALT升高，或ALP升高幅度較ALT升高更明顯；(3)肝血管損傷型(C組)，ALT>3倍ULN，R值≥2(伴血管彩色多普勒超聲表現)；(4)混合型(D組)：ALT>3倍ULN，ALP>2倍ULN，且2

5.ATB-DILI嚴重程度分級：(1)0級(無肝損傷)：患者對暴露藥物可耐受，無肝毒性反應。(2)1級(輕度肝損傷)：血清ALT和(或)ALP呈可恢復性升高，總膽紅素<2.5倍ULN(42.8 μmol/L)，且國際標準化比值(international normalized ratio，INR)<1.5。(3)2級(中度肝損傷)：血清ALT和(或)ALP升高，總膽紅素≥2.5倍ULN，或雖無總膽紅素升高但INR>1.5。(4)3級(重度肝損傷)：血清ALT和(或)ALP升高，總膽紅素≥5倍ULN(50 mg/L 或85.5 μmol/L)，伴或不伴INR>1.5。(5)4級(急性肝功能衰竭)：血清ALT和(或)ALP水平升高，總膽紅素>10倍ULN(17.1 μmol/L)或每小時升高>10 mg/L或17.1 μmol/L，INR>2.0或凝血酶原活動度(PTA)<40%，可同時出現腹腔積液、肝性腦病或與肝損傷相關的其他器官功能衰竭。(6)5級(致命)：因肝損傷死亡，或需接受肝移植才能存活。

6.基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)檢測：采集研究對象晨起空腹靜脈血6 ml，抗凝管裝置混勻后，室溫靜置15～30 min。以1100×g離心15～20 min，收集上清液，如有沉淀需再次離心。血清MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-13、MMP-14濃度檢測采用雙抗體夾心法，試劑盒選用人MMP定量分析酶聯免疫檢測試劑盒[購自上海巧伊生物科技有限公司(貨號分別為ab66062和m1058665)]。酶標儀為美國Molecular Innovations公司的SPECTCA MAX190。酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值(A值)，通過標準曲線計算血清樣本中不同MMP的含量。

結 果

1.基本情況：按照ATB-DILI臨床分型，病例組中A組51例，B組12例，C組15例，D組20例。病例組(各臨床分型亞組)與對照組研究對象各基本特征的差異無統計學意義(表1)。ATB-DILI嚴重程度分級，病例組中1級33例，2級27例，3級22例，4級14例，5級2例。

表1 研究對象基本特征在不同臨床分型ATB-DILI組和健康對照組間分布情況的比較

2.MMP水平組間比較：比較病例組(各臨床分型亞組)和對照組MMP水平差異，發現MMP-1和MMP-9在A組中明顯升高，MMP-2和MMP-14在C組中明顯升高，差異均有統計學意義(表2)。

表2 各基質金屬蛋白酶在不同臨床分型ATB-DILI組和健康對照組間水平的比較

3.MMP水平相關性分析：分析ATB-DILI嚴重程度與MMP水平的相關性，結果顯示，MMP-9與ATB-DILI嚴重程度呈正相關，而MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-13、MMP-14與ATB-DILI嚴重程度無明顯相關性(表3)。

表3 各基質金屬蛋白酶與ATB-DILI嚴重程度的相關性分析

討 論

ATB-DILI的發病機制至今未有定論，目前有多種學說，如炎癥機制、免疫機制、線粒體損傷機制等[7]。炎癥機制學說論證ATB-DILI為藥物導致炎癥因子分泌增加，多重因素致肝細胞損傷[8]。本研究結果顯示，MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-14在ATB-DILI患者中明顯升高，同時，以往研究也證實MMP家族也與多種炎癥效應有關，進一步驗證了炎癥機制學說的可能。

MMP-1與MMP-9均屬于MMP家族中的明膠酶，受多種炎癥因子[如白細胞介素(IL)-1β和IL-6]影響，也在多種炎癥細胞中表達[9]。MMP-1與MMP-9分泌增加，尤其是在肝細胞損傷型ATB-DILI 患者中表達明顯上升，提示MMP-1、MMP-9與肝細胞損傷有關，與相關研究結果相符[10]。MMP-2與MMP-14為MMP家族中的另一類蛋白酶。MMP-14為膜型MMP，與MMP-2互相作用，協同增加分泌及促進血管成纖維細胞增生。MMP-2與MMP-14參與內皮細胞基底膜降解，促進成纖維細胞遷移和增殖，導致新生血管、新生微血管和基底膜形成[11]。MMP-2與MMP-14也參與多種炎癥機制的發生，在炎癥因子刺激下表達增加，促進血管損傷，導致炎癥進展[12]。本研究結果顯示，MMP-2與MMP-14水平在肝血管損傷型ATB-DILI 患者中明顯升高，可能提示MMP-2與MMP-14參與血管損傷，在促進血管異常增生方面作用更為明顯。這種改變與其他MMP以促進炎癥因子分泌為主的表現略有不同，對發現新的影響ATB-DILI發生的因素具有一定臨床意義。

研究發現，在CaC0-2腸上皮細胞中，IL-1β或腫瘤壞死因子(TNF)-α也可使MMP-9的表達水平升高，并分別于刺激后16 h和3 h達到高峰[13]。另有學者使用毛囊細胞、單核細胞、 神經細胞、腎小球足突狀細胞、腹膜間皮細胞等其他細胞培養體系也有類似的發現[14]。以上研究結果充分表明，在多種細胞培養體系中，炎癥細胞因子可影響MMP-9的表達，MMP-9表達升高與疾病進展密切相關[15]。本研究結果顯示，MMP-9與ATB-DILI嚴重程度呈正相關，證實MMP-9分泌增加，炎癥反應持續性進展，肝損傷程度明顯加重。因此，筆者認為，通過研發新型抗MMP藥物降低MMP-9表達，從而減少ATB-DILI的發生，值得進一步探討。

綜上，炎癥反應可以促進MMP表達上調，多種MMP參與炎癥機制及相互促進炎癥因子表達，促進疾病進展[16]。ATB-DILI也是在炎癥機制下由多重因素導致，MMP在其中也具有重要作用。本研究探究了MMP家族中的部分因子對ATB-DILI的影響，后續將對本次研究結論進一步驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突