重視結核分枝桿菌抗原檢測技術研發

孫照剛

結核病疫情防控面臨的新形勢需要考慮新的快速、便捷的早期篩查或診斷技術。該技術既要脫離分枝桿菌培養，又要避免核酸檢測所需要的較為復雜的核酸提取和擴增技術，還要注重生物安全性。因此，簡便、快速和廉價的免疫學診斷技術是結核病研究人員重點關注并且堅持不懈的努力方向。

由于機體被結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染后，體內首先出現的是MTB特異性抗原。MTB抗原的檢測不受宿主免疫功能狀態的影響，可以作為MTB感染的直接證據。盡管世界衛生組織(World Health Organization，WHO)在2011年基于更早的10年間的數據指出：目前市面上商業性血液(血清學)檢測手段診斷活動性結核病，常導致誤診和不當治療[1]。如今，隨著MTB抗原檢測新技術在敏感度和特異度等方面的提高，使得結核病快速確診技術更為可靠。并且，對于菌陰肺結核、難以診斷的肺外結核，以及對免疫功能低下患者等特定群體而言，MTB抗原檢測具有更重要的積極意義，應成為優先考慮的技術研究方向。筆者就MTB抗原檢測的現有進展及未來發展方向進行闡述。

一、目前檢測的MTB抗原靶標

(一)單一抗原檢測

與抗體檢測相對應，抗原檢測是直接檢測患者標本中MTB抗原成分，單一抗原檢測的靶標主要是相對分子質量為14 000、31 000和38 000的蛋白，以及MPT64蛋白、熱休克蛋白65(Hsp65)、Ag85蛋白復合物和脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)等單一組分。這些單一抗原組分的檢測結果表現出明顯的特異度和敏感度的差異，僅有個別研究顯示的其檢測特異度和敏感度都超過了80%。

Silva等[2]采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測結核病患者對相對分子質量為14 000蛋白的體液應答，發現該蛋白的體液應答與非活動性結核病相關，其對非活動性結核病患者的體液反應(平均陽性率：0.18%)低于活動性結核病患者(0.21%)，對結核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)有一定的診斷價值。同樣采用ELISA方法，對結核性腦膜炎(tuberculous meningitis, TBM)患兒腦脊液和血清樣本中的相對分子質量為31 000蛋白抗原的檢測結果證明，其敏感度分別為90%和80%，特異度均為96%[3]；對結核病患者血清中相對分子質量為38 000蛋白抗原檢測的總敏感度為55.2%，陽性預測值為93.5%[4]。唐宇龍等[5]研究表明，MPT64制備的抗體檢測血清標本陽性率不高，但特異度較好，用于檢測臨床診斷的肺結核患者血清標本陽性率為41.2%，檢測非結核病患者和健康對照組血清標本的假陽性率分別為7.1%和53.1%。一項采用間接ELISA方法對TBM患者腦脊液中的Hsp65蛋白抗原進行的前瞻性評估發現，其診斷敏感度和特異度分別為84%和90%[6]。

Ag85蛋白復合物包括Ag85A、Ag85B和Ag85C，是MTB培養液中最常見的分泌蛋白，能誘導體液和細胞免疫反應[7]。Khan等[8]采用間接免疫PCR(I-PCR)和實時定量PCR(RT-I-PCR)方法檢測骨關節結核患者臨床標本(組織活檢、滑膜液和膿液)中Ag85蛋白復合物表達，發現I-PCR檢測骨關節結核確診患者(8例)和臨床疑似患者(51例)的敏感度分別為87.5%和70.5%，特異度均為93.9%(33例非結核病對照者)。值得注意的是，I-PCR/RT-I-PCR檢測敏感度明顯高于ELISA法和GeneXpert法(30例骨關節結核患者)。因此，該檢測方法有望成為一種有潛力的結核病診斷試劑盒。

LAM是一種由多糖和脂類組成的復合物，是MTB細胞壁的重要成分，具有較強的免疫原性[9]。LAM是MTB抗原檢測中最常見的靶向抗原，Flores等[10]系統綜述了LAM抗原在不同類型結核病中的診斷價值，發現各項研究的質量參差不齊。對肺結核診斷敏感度和特異度的范圍分別為2%～100%和33%～100%。對合并HIV感染的肺結核患者尿液LAM檢測發現其敏感度高于未合并HIV感染者。對肺外結核診斷敏感度和特異度的范圍分別為0～100%和62%～100%。五項針對LAM、早期分泌抗原靶6(ESAT-6)、Ag85 復合物和腦脊液中相對分子質量為65 000蛋白抗原檢測TBM的研究合并后顯示，產生的最高敏感度為87%，但特異度低(84%)。因此，仍需要進一步研究以確定LAM檢測對HIV高流行環境中TBM的診斷價值。此外，有研究發現，尿液LAM抗原對兒童結核病有較好的診斷價值，其檢測的敏感度和特異度分別為83%和85%[11]。

由于體液中抗原含量較低，單一抗原檢測的方法較適合應用于腦脊液和支氣管灌洗液等抗原含量相對高的體液標本[4,6,8]，不提倡用于血清等標本的檢測。WHO不提倡活動性結核病的血清抗原檢測。一方面，MTB特異性抗原的發現存在一定難度；另一主要原因在于，血清中抗原含量少，使用目前常規信號放大技術增加了檢測的不準確性。因此，多種抗原同時檢測的方法能夠在一定程度上克服敏感度差的問題，同時也有助于提升特異度。

(二)多種抗原同時檢測

由于患者狀態、菌載量和感染階段的不同，結核病患者對不同MTB抗原的應答反應具有異質性，單一的抗原檢測可能會造成假陽性結果的產生。此外，患者標本抗原含量較低，其用于MTB檢測敏感度低。因此，多種特異性MTB抗原聯合檢測能夠在一定程度上克服敏感度差的問題，同時可以有效提高檢測的特異度[12]。

目前，已有一些較為成熟的蛋白芯片在臨床結核病診斷中得以應用。蛋白芯片主要檢測LAM和相對分子質量為16 000、38 000的蛋白等主要抗原，但其檢測敏感度較低，檢測肺結核和肺外結核患者的陽性率分別為66.4%和35.8%，檢測慢性消耗的肺外結核患者的陽性檢出率明顯低于肺結核患者[13]。Zhou等[14]通過谷胱甘肽S-轉移酶蛋白融合技術針對MTB分泌蛋白和跨膜蛋白成功構建了一個含有Rv0934、Rv1411c、Rv1566c、Rv1623c、Rv1980c和Rv2031c等6個具有強免疫反應性的抗原組合。多抗原聯合檢測試劑盒與市售試劑盒的對比研究顯示，聯合檢測試劑盒對活動性肺結核患者血清檢測敏感度明顯高于市售試劑盒(66.3%與31.6%)。兩種檢測方法的特異度相似，分別為89.6%和90.6%。賀仁忠等[15]共篩選了8種MTB蛋白抗原(Rv1860、Rv2031c、Rv1441c、Rv0494、Rv3301c、Rv0351、Rvl821和Rv0280)，設計了一款新型蛋白芯片，發現其組合檢測LTBI的特異度和敏感度分別達90.9%和83.1%，顯示了較好的診斷效能。Kasempimolporn等[16]從MTB休眠調節單元(DosR)中篩選出Rv2029c、Rv2031c、Rv2032、Rv2627c、Rv3133c、Rv3716c等6種蛋白抗原，制備成檢測試紙，用于檢測患者血清標本，發現檢測LTBI 者的敏感度為75.0%，檢測非LTBI者的特異度為88.1%。在不同臨床情況下(如LTBI、活動性肺結核、結核病患者密切接觸者和其他非結核病患者的血清)，此檢測試紙的陽性預測值和陰性預測值分別為77.4%和86.7%。由此說明，這6種具有較強免疫原性的聯合抗原提高了LTBI檢測的敏感度。

質譜技術的高通量檢測具有同時檢測多種抗原的優勢。Kruh-Garcia等[17]采用多反應監測質譜(MRM-MS)技術鑒定的抗原85B、抗原85C、Apa、BfrB、GlcB、HspX、KatG和MPT64等外分泌蛋白聯合檢測可以用來判斷MTB的活躍狀態。Ma等[18]利用兩種仿生親和層析(biomimetic affinity chromatography，BiAC)培養基(At-23和A115-94)以選擇性的消耗血清中白蛋白和免疫球蛋白，然后分餾后的蛋白進行電噴霧碰撞誘導串聯質譜(ESI-CID-MS/MS)分析，分別鑒定出FbpA、FbpB和BfrB等3種抗原，并經蛋白免疫印跡(Western Blot)驗證，發現FbpA、FbpB和BfrB在經BiAC分離的結核病患者血清標本中具有較高的豐度，提示這3種抗原也可以作為結核病患者檢測潛在的生物標志物，具有較好的應用價值。但是這些研究成果均尚未在臨床實踐中得到應用。其最主要的原因在于質譜和色譜分析操作技術復雜，對操作人員要求較高，同時，設備較為昂貴，并且檢測所需血清標本量較多。因此，尋找新的抗原檢測方法或抗原富集思路對于提高實驗條件較差的基層醫院對各種類型MTB感染的陽性檢出率具有重要意義。有研究報道，采用人的蛋白SMAD2或核呼吸因子1(NRF1)作為配體，可以同時吸附多種MTB特異性抗原[19]。這種基于配體吸附的MTB抗原檢測技術或許是一種簡便、快捷、靈敏的抗原檢測技術。

二、MTB抗原檢測的實現方法

(一)免疫學方法

免疫學方法具有快捷、方便和標準化程度高等優點，是目前MTB抗原檢測的常用方法。免疫學方法主要的技術手段包括ELISA、化學發光、時間分辨熒光免疫分析和側向層析等。這些相應技術的改進提高了MTB抗原的檢出效率。張昆南等[20]應用改進的斑點酶聯免疫吸附法分別檢測TBM患者腦脊液中培養濾液蛋白10(CFP-10)和ESAT-6，發現CFP-10檢測的敏感度為93.1%，特異度為92.5%；ESAT-6檢測的敏感度為91.4%，特異度為94.3%。兩項檢測的敏感度和特異度均高于針對MTB菌體或菌體物質進行檢測的同類研究，如抗酸染色、MTB培養、PCR等。這表明應用改進的斑點酶聯免疫吸附法檢測腦脊液中CFP-10和ESAT-6能提高TBM的診斷效能。Broger等[21]建立了檢測下限為pg/ml范圍內的LAM和ESAT-6的電化學發光(ECL)免疫分析方法，發現檢測尿液標本中LAM和ESAT-6用于結核病診斷的總體敏感度分別為93%和65%，檢測血清標本中LAM和ESAT-6用于結核病診斷的總體敏感度分別為55%和46%；在所有檢測的總體特異度為97%。而且無論HIV感染狀況如何，檢測敏感度的進一步提高都可以通過優化檢測技術和試劑成分來實現。這表明這種方法檢測肺結核患者尿液標本的診斷準確度較高。時間分辨熒光免疫法(TRFIA)是以鑭系元素標記抗原或抗體，并與時間分辨測定技術結合而建立起來的一種新型非放射性微量免疫分析技術，具有高敏感度、可定量、線性范圍寬、穩定性強、成本低等優勢。王雪梅等[22]使用該法測定胸腔積液標本CFP-10水平，取CFP-10表達水平臨界值為11.92 ng/ml時，其檢測結核性胸腔積液的敏感度和特異度分別為96.23%和94.00%，高于結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測血清標本的敏感度和特異度(分別為82.08%和90.00%)。側向層析技術中最常見的實現方法是由膠體金標記技術發展起來的膠體金免疫快速診斷技術，主要有快速斑點免疫金滲濾法和膠體金免疫層析法，具有操作簡便、快速、無需儀器設備，試劑性能穩定及成品易于保存等優點，在近幾年得到快速發展。崔光輝等[23]分別用斑點金免疫滲濾試驗、PCR和痰涂片法檢測肺結核患者血清標本，發現斑點金免疫滲濾試驗檢測陽性率為82.14%，明顯高于痰涂片(37.14%)和PCR(58.57%)。

(二)質譜技術

質譜分析技術在檢測的敏感度、特異度、分析速度、多指標同時檢測等方面有非常大的優勢，在新生兒遺傳代謝病篩查、維生素及激素監測、治療藥物監測、微生物鑒定等領域已有應用。它是將樣品分子經過離子化后，利用其不同質荷比(m/z)的離子在靜電場或磁場中受到的作用力不同而改變運動方向，使其彼此在空間上分離，最后通過收集和檢測這些離子得到質譜圖譜，實現分析目的的一種分析方法。此外，質譜分析技術受樣本處理復雜及成本高等限制，目前尚未大范圍推廣使用。

Fan等[24]用液相色譜-質譜法定量檢測HIV感染者血清中MTB毒力因子CFP-10，發現培養陽性和陰性肺結核患者CFP-10檢出率分別為89.6%和66.7%，檢測非結核病對照組的特異度為88%。血清CFP-10抗原檢測和培養對60例肺結核患者的確診率分別為85%和80.0%。結果表明，該法檢測肺結核患者血清CFP-10效能高，且能發現分枝桿菌培養漏檢的患者。Szewczyk等[25]用電噴霧電離-串聯質譜法分析了在分枝桿菌細胞壁結構中起關鍵作用的分枝桿菌酸。基于10個最豐富和最具特征的多反應監測對，對MTB和幾株非結核分枝桿菌的粗脂肪酸混合物進行了有針對性的分析。該研究發現了分枝桿菌酸的獨特特征，從而能夠可靠地鑒定分枝桿菌種類。在對波蘭結核病患者和非結核病患者的病例-對照研究中，該方法顯示出了快速診斷活動性結核病方面的潛在價值，其敏感度和特異度均超過了現有方法。Nicoara等[26]建立并優化了一種基于選擇性離子監測的氣相色譜-質譜法，用于檢測MTB細胞膜鄰苯二甲酸甘油酯的熱輔助水解和甲基化產物。研究發現，該方法的最低檢出限為400 CFU/ml(CFU為菌落形成單位)，表明其可用于快速定量檢測MTB，有可能應用于人類和獸醫臨床實驗室，以快速診斷結核病。

(三)納米技術

目前，隨著納米技術的不斷發展，利用納米材料的獨特特性檢測MTB生物標志物為結核病的診斷提供了更高效率和準確性。MPT64是MTB生長早期和中期產生的抗原，可誘導體液和細胞免疫反應。Thakur等[27]利用聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-碳納米管納米復合材料研制了一種檢測MPT64抗原的電化學DNA適體傳感器，發現15 min內檢出MPT64的檢出限為0.5 fg/ml，具有較高的敏感度和響應時間。Bai等[28]通過用信號適體標記金納米粒子裝飾的富勒烯-聚苯胺納米復合材料(GNPs-C60-Pan)，構建了一種新型基于信號生成和放大的相對簡單且超靈敏的電化學適體傳感器，用于測定MPT64抗原。研究觀察到MPT64的線性檢測范圍為0.02～1000 pg/ml，檢測限為20 fg/ml，具有對目標抗原高選擇性的特點。更重要的是，它對結核病患者血清樣本中MPT64的檢測也表現出良好的特異度和敏感度，為檢測MTB感染提供了一種快速和高效的方法。Chen等[29]利用一種新型的由富勒烯納米粒子、氮摻雜碳納米管和氧化石墨烯組成的碳納米復合材料(C60NPs-N-CNTs/GO)，研制了一種新型的夾心型電化學適體傳感器。研究發現，在最優條件下該適體傳感器對MPT64的線性檢測范圍為1 fg/ml～1 ng/ml，檢測限低至0.33 fg/ml，并成功用于人血清中MPT64抗原的檢測，顯示出良好的應用前景。

目前，MTB抗原檢測的納米技術不斷發展。與傳統結核病檢測方法相比，納米技術具有更高的檢測效能。盡管如此，構建一種快速、經濟和便捷的檢測臨床標本的納米技術，仍面臨諸多挑戰。高成本、復雜的儀器和技術要求限制了納米技術在結核病高負擔的低收入和發展中國家中的使用。因此，基于納米材料的便攜式結核病檢測技術仍需不斷發展。

三、問題與展望

綜上所述，隨著技術的進步，MTB抗原在檢測技術和研究思路上都取得了較大的進展，但仍存在一些問題。首先，敏感度高的特異性抗體和相應的商業化試劑盒缺乏，雖有高效抗體報道，但仍局限于小樣本研究，缺乏大樣本量的臨床評估。此外，痰液、支氣管灌洗液和胸、腹腔積液等蛋白或細胞成分含量較高的臨床標本中MTB抗原濃度低，檢測困難。

MTB抗原研發的方向應注重多種特異性抗原同時檢測。隨著新型納米材料和傳感方法的發展，這些材料和傳感方法可以通過增強各種因素，包括選擇性、敏感度、長期穩定性、再現性和成本效益等，為結核病的快速診斷帶來新的前景。隨著特異性強、免疫原性好的抗原的不斷發現和研究，在新的抗原富集方法和信號放大技術的支持下，MTB抗原檢測必將得到新的完善和發展，并且因其在標本處理、操作步驟及儀器設備等方面具有優勢而獲得更多青睞。