宿主轉錄標志物GBP5、DUSP3和KLF2的研究進展

韓婷婷 陳秋奇 鄧國防

結核分枝桿菌引起的結核病是世界范圍內一個主要的健康問題，是單一感染源導致死亡的主要原因[1]。及時予以適當的治療對結核病的控制以及減少其在社區中的傳播至關重要，而減少全球結核病負擔的關鍵要求是尋找到更好的診斷方法和監測治療反應的工具[2]。2021年WHO報告的全球新發的987萬例結核病患者中，41%的患者是未經細菌學證實的[3]。這表明現有的診斷方法，存在一定的缺陷和不足[4-5]。因此，可改善結核病臨床診斷并用于結核病治療監測的基因宿主轉錄標志物鳥苷酸結合蛋白5(guanylate binding protein5,GBP5)、雙特異性磷酸酶3(dual specificity phosphatase3，DUSP3)、Krüppel樣轉錄因子2(Krüppel-like transcription factor2,KLF2)，具有一定的臨床價值，筆者從這3個基因宿主轉錄標志物的發現、發展、臨床價值和局限性等方面進行綜述。

一、 宿主轉錄標志物在結核病診斷中的價值

活動性結核病(active tuberculosis，ATB)主要是根據患者的癥狀、體征、病理和細菌學證據進行診斷的[1]。活動性結核病的實驗室診斷標準是從標本中檢測出結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)。由于標本獲取難度較大(如難以從癥狀已改善的患者中獲取合格的痰液標本)以及實驗室檢查方法在肺外結核中缺乏敏感度，僅約60%的患者能夠通過實驗室檢查確診[6]。結核病分子生物學診斷方法GeneXpert MTB/RIF雖然在菌陽結核病患者中有著良好的效果，極大地提高了結核病的診斷能力，但其在菌陰結核病患者中敏感度較低，且不能用于監測抗結核治療過程中的治療反應[4, 7]。其次，這一方法依賴于痰標本[7]，但痰標本在患者癥狀改善后較難獲得。雖然可以使用支氣管肺泡灌洗液作為痰液的替代品，但其在資源有限的國家中較難普及，支氣管鏡在兒童中也較難實施[1, 7]。因此，尋求一種不依靠痰標本即可監測結核病治療反應的檢測方法是必要的。而γ干擾素釋放試驗雖然不使用痰標本即可用于結核分枝桿菌感染的診斷，但其無法區分活動性結核病和結核分枝桿菌潛伏感染，并且在合并人類免疫缺陷病毒感染時其結果容易受影響。因此，目前存在的方法具有一定的局限性，人們迫切需要一種基于血標本即可準確診斷結核病的新型免疫學診斷方法，從而解決菌陰結核病，活動性結核病和結核分枝桿菌潛伏感染的診斷與鑒別診斷問題[4, 7]。基于血液宿主轉錄標志物的診斷方法正是一種潛在的解決方案。

研究表明，宿主轉錄標志物可以區分不同的傳染病[8]。利用血液標志物轉錄的方法，人們能夠更好地了解宿主對疾病的反應，有助識別用于診斷、治療監測和預后的潛在生物標志物。且這一檢測基于血液而不依賴痰，其標本易于獲得，簡單便捷，在應用于結核病的診斷和治療監測方面有很大的優勢[1]。在低發病率和高發病率環境中的幾項研究均證實全血轉錄標志物可提供宿主對結核病反應的廣泛視角，顯示出結核病與健康對照、結核與其他疾病、結核病與結核分枝桿菌潛伏感染的準確區別[5]。Zak等[9]對血液RNA標志物預測結核病疾病風險的前瞻性隊列研究結果中也表明，在結核病出現前18個月的任何一個時間點，通過全血基因表達檢測，可以預測從潛伏感染到活動性疾病的進展。因此，這些研究都證實了宿主血液轉錄標志物在結核病診斷和治療監測中的重要價值，為研究可推廣的、廉價的診斷和治療監測方法提供了新思路。近10年來，已經提出了幾種基于宿主反應的生物標志物系統，以區分活動性結核病和結核分枝桿菌潛伏感染、健康對照者和其他疾病，并預測結核分枝桿菌潛伏感染到活動性結核病的進展[10]。這些轉錄標志物的提出與驗證，展現了其在結核病診斷與治療監測方面的巨大潛力，人們可在臨床實施中推行基于宿主反應的診斷方法[10]。

二、 宿主轉錄標志物在結核病治療療效評估中的價值

Thompson等[11]研究證實，臨床上可應用的宿主血液RNA標志物可預測結核病的治療結果。結核分枝桿菌感染可誘導某些基因的轉錄[12]，使機體某些轉錄標志物發生變化。而在治療開始2周后，血液檢測很容易就發現轉錄標志物發生的顯著變化，這證明了血液轉錄標志物可以作為治療成功反應的早期替代生物標志物[13]，且結核病特異性基因表達標志物會隨著抗結核方案的變化而發生變化[14]，意味著這些標志物可能用于抗結核治療的監測和指導治療方案的制定。O’Garra等[15]觀察到活動性結核病患者的轉錄標志物在治療2個月后開始減弱，并在治療12個月后完全消失，這表明血液中的轉錄標志物與活動性結核病患者的疾病嚴重程度相關，并可反映疾病部位的變化。一項用于結核病診斷和治療監測的6個基因血液轉錄組學標志物(RISK6)的多國評估發現，與健康對照者相比，活動性結核病的基線RISK6標志物評分更高，隨著治療的進行，這一評分逐漸降低，并在治療結束時降至健康對照者的評分水平。此外，RISK6標志物評分還能高精度區分未治療、治療開始的第2個月、治療結束時和治療完成后2個月臨床治愈的結核病患者[16]。已發表的10個基因標志物也會隨著抗結核治療而發生變化，使其可能用于監測結核病治療效果和預測復發[17-18]。Heyckendorf等[19]也指出基因標志物指導的治療管理可能會大大縮短耐多藥結核病患者治療的持續時間。這些研究都表明活動性結核病患者的血液轉錄標志物可作為監測結核病治療效果的強大工具，并指導患者的個體化治療。

三、 GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉錄標志物的發現

生物標志物組合中標志物數量的增加雖然可能提高診斷的準確性，但幾乎所有可用于檢測宿主轉錄反應的商業平臺都受其可檢測的標志物數量的限制，因此需要整合出一個在多重檢測中具有診斷準確性高的生物標志物組合，用作結核病診斷和治療監測[1]。世界衛生組織發布的目標產品配置(targetproductprofile，TPP)確定新的結核病診斷方法應具備使用非痰樣本(如血液)、在人類免疫缺陷病毒合并結核分枝桿菌感染的患者中總體敏感度保持在80%以上、在菌陽兒童結核病患者中的敏感度超過66%以及操作相對簡單等理想特征[7]。為滿足這些要求，應尋找快速、準確、便利的診斷準確性高且可在商業平臺上檢測的生物標志物組合，Sweeney等[7]對來自公共數據集的樣本進行綜合多隊列分析，他們發現了可用來診斷活動性結核病的3個基因宿主轉錄標志物(GBP5、DUSP3和KLF2)，并驗證了它們的診斷能力，證明GBP5、DUSP3和KLF2可以區分活動性結核病和結核分枝桿菌潛伏感染、健康對照者和其他疾病，且其表達不受HIV感染狀況、細菌耐藥性或是否進行卡介苗接種的影響。同時，GBP5、DUSP3和KLF2與活動性肺結核的嚴重程度顯著相關，它隨疾病嚴重程度的增加而增加，隨治療進程的推進而減少，在治療結束時恢復到與健康對照組相同的水平，因此，其不僅可用于監測結核病的治療反應[7]，還有助于新藥物的開發。因為藥物的開發一直受到缺乏可靠的反映疾病嚴重程度和治療效果的生物標志物的阻礙[20]。隨后，Francisco等[21]的研究也確定GBP5和KLF2可用作活動性結核病的診斷工具，雙基因宿主轉錄標志物也可作為監測活動性結核病治療的替代生物標志物，進一步證實了3個基因宿主轉錄標志物在臨床應用中的可行性。

四、GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉錄標志物的發展

最初，Sweeney等[7]提出這3個生物標志物，并使用RT-qPCR算法計算，將3個基因TB評分(簡稱“TB評分”)定義為: 3-gene TB score=(GBP5+DUSP3)/2-KLF2，Warsinske等[22]利用嵌套式病例對照研究分析了3個隊列中的TB評分，假設在 4% 的患病率下，TB 評分診斷活動性結核病患者的敏感度為90%、特異度為70%、陰性預測值為99.3%。在參與研究的隊列中，TB評分均能準確診斷出活動性結核病患者，且該評分與患者痰檢結果轉陽的前6個月從結核分枝桿菌潛伏感染發展為活動性結核病的進展顯著相關。TB評分還與活動性結核病患者肺部炎癥的嚴重程度相關。在確診時，TB評分高于中位數的患者發生持續性肺部炎癥的可能性是低于中位數患者的3倍，并且在治療結束時，發生持續性肺炎患者的TB評分也較高。這些結果表明，TB評分在監測結核分枝桿菌潛伏感染個體、結核病的進展、活動性結核病的診斷、患者肺部的病理變化以及評估治療反應方面有很大的潛力[22]。Zimmer等[23]的前瞻性評估中TB評分于治療的第1個月內快速增加[TB評分的中位數增加倍數：1.08(IQR：0.54～1.52)]，并在治療4個月后趨于平穩[TB評分中位數：1.97(IQR：1.03～2.33)]。在治療的第1個月，TB評分快速和大幅增加，有望早期識別對結核病治療有反應的患者。4個月時TB評分變為平臺期可能表明疾病的早期清除，可用于指導縮短治療療程。肺結核的標準方案治療包括2個月的異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RPM)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)和吡嗪酰胺(pyrazinamid，PZA)聯合應用的強化期和4個月異煙肼、利福平的鞏固期。肺外和播散性肺結核有時則需要更長時間的治療：(1)淋巴結結核6個月；(2)關節或骨性結核9個月；(3)中樞神經系統結核12個月[24]。結核病的治療最少需要6個月的時間，長時間的治療會降低患者的依從性，而治療依從性是結核病治療成功的一個重要組成部分[25]。TB評分的平臺期則有望指導縮短治療的療程，從而增加結核病患者的依從性，提高治愈率。為了將這3個基因標志物規模化，Cepheid(Sunnyvale, CA, USA)開發了一種基于試劑盒的原型測試(“Xpert MTB Host Response”或Xpert-MTB-HR-Prototype)，將其整合到一個測試平臺中，利用GeneXpert檢測全血中標志物的表達水平[23]，量化患者全血樣本中3個基因標志物的相對 mRNA 水平，直接分析指尖血[26]，滿足了Sweeney等[7]對這3個基因宿主轉錄標志物可在低功耗設備和利用少量的PCR靶點即可運行的預期。S?dersten等[26]的研究也確定了3個基因宿主轉錄標志物在該原型測試系統中實施的可行性，證實了該試劑盒系統中標志物的性能，并再次表明其在分診測試中能夠滿足世界衛生組織最低的目標產品配置。該試劑盒也特別適用于某些難以提供痰標本的患者，如人類免疫缺陷病毒感染者(PLHIV)，其在人類免疫缺陷病毒感染合并活動性結核病的患者中，敏感度為 90%。

五、GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉錄標志物的臨床應用價值和不足

Warsinske等[10]對已提出的16個用于診斷活動性結核病的基因標志物進行系統比較，他們發現，一個生物標志物組合中標志物數量的增加并不能提高組合的準確性。在眾多標志物組合中，只有GBP5、DUSP3和KLF2基因標志物組合的標志物少于10個，符合世界衛生組織的目標產品配置，且已證明其可在痰培養轉化為陽性的前6個月預測活動性結核病的進展、可在主動篩查中區分活動性結核病、跟蹤治療反應，以及對診斷時患有活動性結核病且治療后出現亞臨床活動性結核病可能性較高的患者進行分層。Turner等[27]人在系統評價確定的 27 個符合條件的標志物中，GBP5、DUSP3和KLF2基因標志物組合獲得了最高的診斷準確度，與年齡、性別、HIV 狀態、既往結核病史或痰涂片結果無關[27]。Hoang等[5]的研究也證實，GBP5、DUSP3和KLF2基因標志物組合在檢測活動性肺結核、培養陽性肺結核、高度可能肺結核和肺外結核方面表現最好。這些研究都表明了3基因標志物在結核病診斷和治療監測方面的重要價值。

GBP5、DUSP3和KLF2基因標志物組合符合WHO分診測試的最低目標產品概況(敏感度90%，特異度70%)，但其沒有符合結核病分診測試的最佳標準(敏感度95%，特異度80%)，或符合確診性試驗的最低標準(敏感度65%，特異度98%)。在符合條件的標志物中，GBP5、DUSP3和KLF2基因標志物組合雖然具有最高診斷準確性，但其缺乏特異性，無法用于確診結核病[27]。Hoang等[5]對臨床實踐中診斷結核病的轉錄標志物的一項前瞻性、多中心隊列研究中，發現所有已發表的轉錄標志物(包括GBP5、DUSP3和KLF2)在臨床實踐中均缺乏診斷準確性、敏感度和特異度。在常規的實踐環境中，當結核病必須與其他臨床表現相似的疾病區分開時，轉錄標志物不能表現出足夠的診斷準確性，不可用于臨床。這與Turner等[27]的研究結果是一致的。GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉錄標志物的診斷特異性不足以提供足夠可靠的陽性結果來啟動結核病治療。這些發現，表明了GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉錄標志物在臨床上的應用還面臨著許多挑戰，它并不是在所有的條件下均有較高的性能。

六、 問題與展望

目前可用于診斷結核病的宿主轉錄標志物是多樣的，而現有的研究表明，GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉錄標志物組合在所有已提出的標志物中表現得最好[5,10]，雖然其在臨床常規實踐中無法用于確診結核病，但其在檢測結核分枝桿菌潛伏感染的個體、結核病的進展以及評估治療反應的潛力是不可否認的，且其已經開發出可以使用的試劑盒(Xpert-MTB-HR-Prototype)將其整合到測試平臺中檢測其在全血中的表達水平，使其在臨床中應用成為可能。未來，我們對其研究可致力于將TB評分與其他的診斷方法結合起來，從而增加其診斷的性能。且現有的研究已證實GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉錄標志物組合可在痰培養轉化為陽性的前6個月預測活動性結核病的進展，表明其有望成為一種篩查的手段，在人群中篩查出可能進展為活動性結核病的結核分枝桿菌潛伏感染者，從而指導提前進行干預，阻斷結核病發展進程。但這一設想，必定受Xpert-MTB-HR-Prototype的價格、穩定性、對檢測人員的要求等限制。因此，控制成本及其操作難度，是GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉錄標志物組合廣泛應用面臨的難題。雖然GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉錄標志物組合的研究結果令人鼓舞，但其在臨床應用的實際性能、其測試平臺的開發、以及在實踐過程中的實用性仍需不斷的進行探索。

利益沖突聲明所有作者均聲明無利益沖突

作者貢獻韓婷婷：查閱文獻，撰寫論文；陳秋奇：審閱修改；鄧國防：審閱修改，指導撰寫