熒光PCR熔解曲線法檢測耐多藥肺結核患者對左氧氟沙星和莫西沙星耐藥性的效能研究

金龍 田琦 張寶慶 邢海冬 高明霞 張秀英 王利華 張曉磊

氟喹諾酮類藥物是治療耐藥結核病的重要藥物，然而近年來，結核分枝桿菌對這類藥物的耐藥率逐漸增加[1]。因此，氟喹諾酮類藥物耐藥性檢測已成為結核病臨床治療方案制定中不可或缺的依據。依賴于培養及藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)的傳統耐藥性檢測方法至少需要6～8周才能得到結果，極易延誤病情。分子藥敏試驗技術的發展克服了傳統表型藥敏試驗檢測時間長的缺點[2]。其中，熒光PCR熔解曲線法通過對結核分枝桿菌的gyrA基因進行擴增，并設計特異探針檢測氟喹諾酮類藥物耐藥決定區(gyrA88～94密碼子)，可以在2.5 h內得出氟喹諾酮類藥物耐藥信息，是目前快速檢測結核分枝桿菌耐藥性的新型分子生物學方法之一[3]。目前，關于熒光PCR探針熔解曲線法檢測氟喹諾酮類藥物耐藥的臨床研究較少，特別是同時針對左氧氟沙星(levofloxacin，Lfx)和莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)的研究數據較為匱乏。本研究就2018年11月至2019年12月在黑龍江省傳染病防治院經熒光PCR熔解曲線法，以及BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養聯合藥敏試驗兩種方法臨床確診的耐多藥肺結核(multidrug-resistant pulmonary tuberculosis，MDR-PTB)患者進行分析，探討熒光PCR熔解曲線法快速檢測結核分枝桿菌對Lfx和Mfx耐藥性的臨床價值。

資料和方法

一、資料收集

收集2018年11月至2019年12月黑龍江省傳染病防治院經過熒光PCR熔解曲線法篩查，并經BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養及藥敏試驗確診為MDR-PTB患者的痰液樣本。研究期間本院收治符合條件的患者共計195例，均為復治患者，其中男性112例，女性83例；年齡17～78歲，平均年齡(45.0±11.5)歲。

二、實驗方法

1. 結核分枝桿菌基因組DNA的提取：收集到的痰液樣本均采用廈門致善生物科技股份有限公司生產的Lab-Aid 824S核酸自動提取儀進行基因組DNA的提取，嚴格按照說明書步驟進行操作。

2. 熒光PCR熔解曲線法：(1)操作方法：嚴格按照廈門致善生物科技股份有限公司生產的結核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)說明書進行實驗操作。(2)結果判定方法：通過比較所檢測樣本與陽性對照樣本之間熔解曲線的熔點(Tm值)的差異判斷樣本是否發生突變：樣本的熔點與陽性對照的熔點一致(誤差不超過1 ℃)時判定為野生型，待檢樣本對氟喹諾酮類藥物敏感；樣本的熔點低于陽性對照2 ℃及以上時(△Tm≥2 ℃)判定為突變型，待檢樣本對氟喹諾酮類藥物耐藥。

3. 分枝桿菌培養及藥敏試驗方法：應用BACTEC MGIT 960系統對收集的肺結核患者的痰標本進行快速培養，再對培養陽性的標本進行比例法藥敏試驗，包括Lfx和Mfx兩種藥品。藥物敏感性檢測試劑購于珠海市銀科醫學工程股份有限公司，臨界濃度分別為2.0 μg/ml和0.25 μg/ml。所有操作均嚴格按照《結核病實驗室檢驗規程》[4]和試劑或設備說明書進行。整個檢測過程需要2～3個月。

三、質量控制

本課題組人員均進行過嚴格的項目啟動培訓，掌握實施方案。項目實施過程中嚴格按照實施方案標準進行患者納入、表格登記、實驗操作、結果判斷等。結核病實驗室每天做好相關儀器設備的維護保養，在實驗操作過程中嚴格做好實驗室質量控制。

四、統計學處理

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。以比例法藥敏試驗為標準，計算熒光PCR熔解曲線法的敏感度、特異度、一致率和Kappa值。Kappa值在0.00～0.20為極低一致；Kappa值在0.21～0.40為一般一致；Kappa值在0.41～0.60為中等一致；Kappa值在0.61～0.80為高度一致；Kappa值在0.81～1.00為完全一致。

結 果

一、熒光PCR熔解曲線法檢測結果

195株結核分枝桿菌經熒光PCR熔解曲線法檢測，有114株發生gyrA基因突變，81株未發生突變。

二、比例法藥敏試驗結果

195株結核分枝桿菌經比例法藥敏試驗檢測，Lfx耐藥90株，敏感105株，Lfx總耐藥率為46.15%(90/195)；Mfx耐藥95株，敏感100株，Mfx總耐藥率為48.72%(95/195)。

三、熒光PCR熔解曲線法檢測效能評價

以比例法藥敏試驗結果為標準，熒光PCR熔解曲線法檢測結核分枝桿菌對Lfx耐藥性的敏感度為95.56%，特異度為73.33%，一致率為83.59%，Kappa值為0.83；檢測結核分枝桿菌對Mfx耐藥性的敏感度為95.79%，特異度為77.00%，一致率為86.15%，Kappa值為0.85。見表1。

表1 熒光PCR熔解曲線法檢測195株耐多藥結核分枝桿菌對左氧氟沙星和莫西沙星耐藥性的效能

熒光PCR熔解曲線法檢測結果與比例法藥敏試驗結果不一致的樣本共有32株，其中，28株藥敏試驗檢測為敏感而熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變，4株藥敏試驗檢測為耐藥而熒光PCR熔解曲線法檢測為無耐藥突變。對于藥敏試驗檢測為敏感而熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變的28例患者，均已根據分子診斷結果進行個體化用藥，均已臨床治愈；另外4例藥敏試驗檢測為耐藥而熒光PCR熔解曲線法檢測為無耐藥突變的患者，已按照敏感肺結核進行治療，均已臨床治愈。

討 論

耐藥結核病，尤其是耐多藥結核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結核病(XDR-TB)是結核病防治領域的兩大難題[5-7]。根據世界衛生組織的推薦意見，以及藥物的有效性、安全性和可及性，二線抗結核藥物氟喹諾酮類藥物中的Lfx和Mfx可以作為耐藥結核病治療的首選藥物[8]。傳統的表型藥敏試驗檢測方法需要進行痰培養，周期往往長達4～8周，無法及時指導臨床用藥[4]。基于此，若能實現痰液直接檢測，快速診斷出氟喹諾酮類藥物耐藥的患者，將有助于醫生選擇用藥方案，可以成為減少耐藥結核病流行和提高MDR-TB和XDR-TB治療成功率的可靠保證[9]。

近年來，隨著分子生物學檢測技術的發展，結核分枝桿菌耐藥相關基因的分子檢測方法被廣泛應用于耐藥結核病的臨床診斷中[10]。目前市面上大多數商業試劑盒只能檢測一線抗結核藥物的耐藥性，如賽沛公司的GeneXpert MTB/RIF試劑盒只能檢測利福平一種藥品的耐藥情況[11]，成都博奧晶芯生物科技有限公司的結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒(DNA微陣列芯片法)只能檢測利福平和異煙肼兩種一線抗結核藥品的耐藥情況[12]；德國Hain Lifescience GmbH公司的GenoType MTBDRsl試劑盒雖然可以對MDR-TB患者進行氟喹諾酮類藥物和二線注射類藥物的耐藥突變檢測[13]，但是該試劑需要PCR后進行處理，操作復雜，極易造成污染，導致假陽性。與以上這些試劑盒相比，熒光PCR熔解曲線法能同時檢測4種一線抗結核藥物(包括利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素)和氟喹諾酮類藥物(Lfx和Mfx)的耐藥情況，并有多項研究表明，其具有敏感度高、特異度強、簡便快速、閉管檢測(無需PCR后處理)等優點，已被廣泛用于臨床結核分枝桿菌耐藥性的檢測[14-17]。

本研究結果顯示，以比例法藥敏試驗為標準，熒光PCR熔解曲線法檢測結核分枝桿菌對Lfx耐藥性的敏感度為95.56%，特異度為73.33%，一致率為83.59%；檢測結核分枝桿菌對Mfx耐藥性的敏感度為95.79%，特異度為77.00%，一致率為86.15%。采用相同的檢測方法，李國利等[14]研究檢測Lfx的敏感度為97.01%，特異度為99.55%，一致率為99.21%；曹志華等[17]研究檢測氟喹諾酮類藥物的敏感度為93.75%，特異度為96.35%，一致率為96.08%；蔚鳴等[18]研究檢測Lfx的敏感度為92.65%，特異度為95.81%，一致率為94.89%；檢測Mfx的敏感度為87.50%，特異度為76.78%，一致率為77.87%。本研究檢測Mfx的特異度與蔚鳴等[18]的研究一致，但低于曹志華等[17]的研究；檢測Lfx的特異度均低于上述研究，分析其原因，可能包括以下幾點。

1. 痰液樣本在培養后的細菌比例可能會發生變化，導致檢測不同樣本類型的特異度存在差異。李國利等[14]和曹志華等[17]的研究中，熒光PCR熔解曲線法檢測的樣本類型均為結核分枝桿菌臨床分離株，而本研究檢測的是痰液樣本。已有研究報道，在發生氟喹諾酮類藥物耐藥突變的樣本中，同時含有敏感菌和耐藥菌的樣本比例高達23%[19]，痰液樣本在液化處理的過程中，部分細菌失去活性，在同時含有敏感菌和低比例耐藥菌的樣本中，少量耐藥菌的活性進一步下降，導致在培養的過程中耐藥菌沒有被培養出來，該樣本被錯誤地判定為敏感。熒光PCR熔解曲線法檢測的是結核分枝桿菌的基因組DNA序列，與細菌的活性無關。因此，在上述這種情況下，樣本的耐藥突變菌株會被檢測出來，判讀為耐藥突變。此外，樣本經過培養后細菌含量及比例可能會發生變化，影響藥敏試驗結果。而以上2個研究檢測的是菌株樣本，不存在直接檢測痰液樣本所導致的問題。

2. 培養方法的不同可能會導致比例法藥敏試驗的結果存在差異。本研究與李國利等[14]和曹志華等[17]的研究在培養方法和比例法藥敏試驗的操作方面有所差異，導致特異度偏低。以上2個研究的培養方法為固體培養法，而本研究采用的是BACTEC MGIT 960液體培養法，對藥敏試驗結果判定會有一定的影響。gyrA基因中的部分突變類型，例如G88A、D89N、A90V、S91P、D94A等僅能引起較低的耐藥水平[20-21]，當菌株處于耐藥與敏感的臨界水平時，在進行比例法藥敏試驗過程當中，若采用的培養方法有所差異、操作人員存在實驗操作上的偏差，或者藥物濃度稍有偏差，有可能造成原本低度耐藥的菌株被判定為敏感，而熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變。因此，以藥敏試驗為標準，以上的差異會導致本研究中熒光PCR熔解曲線法的特異度偏低。

3. 臨界藥物濃度選擇可能會影響臨界菌株的藥敏試驗結果。處于耐藥與敏感臨界水平的菌株，對其藥物敏感性的判斷，往往與藥物的臨界濃度相關。本研究所采用的兩種藥物的臨界濃度不一定為最佳臨界濃度，這可能也是導致本研究中熒光PCR熔解曲線法相比以上3個研究特異度偏低的原因之一，尤其是與蔚鳴等[18]的研究相比，本研究與其在上述兩個原因方面均不存在明顯差異，臨界濃度的差異可能是兩者特異度相差較大的主要原因。

但總體上看，即使本研究檢測的樣本為痰液樣本，熒光PCR熔解曲線法依然具備良好的檢測效果，與培養結果有極高的一致性，為該方法直接檢測痰液樣本中結核分枝桿菌的耐藥情況提供了科學依據。

本次研究共發現32份兩種方法檢測結果不一致的樣本，經過病歷信息查詢，對于藥敏試驗檢測為敏感而熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變的28例患者，均已根據分子診斷結果進行了個體化用藥，并且均已臨床治愈；而另外4例藥敏試驗檢測為耐藥而熒光PCR熔解曲線法檢測為無耐藥突變的患者，由于對利福平和異煙肼的分子診斷結果也均為無耐藥突變，已按照敏感肺結核進行治療，并取得了理想的治療效果，這進一步體現了熒光PCR熔解曲線法快速檢測結核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物(Lfx和Mfx)耐藥性的重要臨床價值。

本研究尚存在一些不足之處。沒有將納入研究的樣本進行測序，導致無法進一步證實熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變，而比例法藥敏試驗檢測為敏感的樣本是否發生低度耐藥突變。此外，本研究為回顧性研究，在患者選擇方面存在一定偏倚，排除了某些因含菌量少而無法獲得實驗結果的患者，從而對評價結果造成一定的影響。

綜上所述，本研究通過直接檢測痰液樣本，并與藥敏試驗標準進行對比，證明熒光PCR熔解曲線法可以快速檢測結核分枝桿菌對Lfx和Mfx的耐藥性，且其檢測結果與藥敏試驗結果高度一致，對臨床判斷結核分枝桿菌耐藥類型和制定合理的化療方案具有重要價值。