金剛鸚鵡性別的快速分子生物學(xué)鑒定

朱向蕾 王瑛瑩 周立晨

摘要 應(yīng)用引物2550F/2718R對(duì)上海動(dòng)物園內(nèi)藍(lán)黃金剛鸚鵡和紅綠金剛鸚鵡的CHD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行性別鑒定。經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)：雄性個(gè)體擴(kuò)增出1條片段，大小647 bp;雌性個(gè)體擴(kuò)增出2條片段，大小分別為630和411 bp。藍(lán)黃金剛鸚鵡群體的雌雄比為10∶17，紅綠金剛鸚鵡群體的雌雄比為5∶4。該方法能準(zhǔn)確、快速、有效地進(jìn)行2種金剛鸚鵡的性別鑒定，為該鳥(niǎo)類(lèi)種群飼養(yǎng)繁育提供基礎(chǔ)性別信息。

關(guān)鍵詞 金剛鸚鵡;性別鑒定;CHD基因

中圖分類(lèi)號(hào) S 865.3+5? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）01-0099-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.025

Rapid Molecular Biology Identification of the Sex of Macaw

ZHU Xiang-lei， WANG Ying-ying， ZHOU Li-chen

（Shanghai Zoo， Shanghai 200335）

Abstract Primers 2550F/2718R were used to amplify CHD gene of Ara ararauna and Ara chloropterus in Shanghai Zoo by PCR. Agarose gel electrophoresis results showed that the male individuals amplified one band with the length of 647 bp， while the female individuals amplified two bands with the length of 630 and 411 bp respectively. The male-female ratio of A. ararauna was 10∶17. The male-female ratio of A. chloropterus was 5∶4. This method could accurately， quickly and effectively identify the sex of two species of macaw， and provide the basic sex information for the feeding and breeding of macaw population.

Key words Macaw;Sex identification;CHD gene

基金項(xiàng)目 上海市綠化和市容管理局科研專(zhuān)項(xiàng)（GZ180409）;上海動(dòng)物園科技攻關(guān)項(xiàng)目（SZ170305）。

作者簡(jiǎn)介 朱向蕾（1985—），女，河北冀州人，工程師，碩士，從事野生動(dòng)物科學(xué)研究工作。通信作者，工程師，博士，從事野生動(dòng)物科學(xué)研究工作。

收稿日期 2021-04-19

金剛鸚鵡隸屬鸚形目鸚鵡科，原產(chǎn)于美洲熱帶地區(qū)，屬于大型攀禽，已列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟》（IUCN）瀕危物種紅色名錄。目前國(guó)內(nèi)多家動(dòng)物園引入飼養(yǎng)金剛鸚鵡，但其繁殖率較低，種群質(zhì)量堪憂(yōu)。影響金剛鸚鵡繁殖的因素很多，包括營(yíng)養(yǎng)、激素水平、氣候、溫濕度、群體密度以及性別比例等。

性別作為基礎(chǔ)信息，是鳥(niǎo)類(lèi)主要的生物學(xué)特征。鳥(niǎo)類(lèi)性別不僅會(huì)影響繁殖配對(duì)和育種，而且會(huì)對(duì)飼養(yǎng)管理、遺傳疾病防治、生態(tài)學(xué)、種群遺傳分析以及瀕危珍稀鳥(niǎo)類(lèi)的保護(hù)研究等方面具有重要影響[1-2]。然而，世界上超過(guò)50%的鳥(niǎo)類(lèi)屬于單態(tài)性鳥(niǎo)類(lèi)，雌雄同型，該類(lèi)型鳥(niǎo)類(lèi)無(wú)論成鳥(niǎo)還是幼鳥(niǎo)均很難從外觀形態(tài)上進(jìn)行性別判定[3]，金剛鸚鵡亦是如此。鸚鵡性別鑒定的方法有很多。吳建民等[4]總結(jié)了目前鸚鵡性別鑒定的常用技術(shù)方法，包括形態(tài)學(xué)方法（行為判定、翻肛判定、外科手術(shù)判定、排泄物類(lèi)固醇判定、叫聲判定、體尺測(cè)量判定、羽色伴性遺傳判定等）、細(xì)胞生物學(xué)方法、分子生物學(xué)方法（隨機(jī)多態(tài)性DNA、微衛(wèi)星、小衛(wèi)星）等方法。然而，這些方法的成功與否取決于實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施和研究人員的專(zhuān)業(yè)知識(shí)及經(jīng)驗(yàn)積累，有的過(guò)程煩瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，因此探索快速、準(zhǔn)確、有效的鑒定方法對(duì)于珍稀鳥(niǎo)類(lèi)飼養(yǎng)管理與繁育工作十分必要。

以CHD基因（chromobox-helicase-DNA binding gene）為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于非平胸目鳥(niǎo)類(lèi)的性別鑒定中[5]。CHD基因全稱(chēng)為染色體螺旋蛋白基因，屬于功能性基因，非平胸目鳥(niǎo)類(lèi)有2個(gè)同源拷貝CHD-W和CHD-Z，雄性個(gè)體只有1個(gè)拷貝CHD-Z;瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果只顯示1條條帶，雌性個(gè)體有2個(gè)拷貝CHD-Z和CHD-W，可顯示出2條條帶，雙陽(yáng)性的帶型特征排除了假陰性的可能，結(jié)果準(zhǔn)確可靠[6]，可作為鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定的有效方法。

目前，尚未見(jiàn)到國(guó)內(nèi)有針對(duì)金剛鸚鵡的性別鑒定相關(guān)報(bào)道。筆者通過(guò)分子生物學(xué)手段在已有研究的基礎(chǔ)上，采用非損傷性取樣的方式快速、準(zhǔn)確地鑒定藍(lán)黃金剛鸚鵡（Ara ararauna）和紅綠金剛鸚鵡（Ara chloropterus）的性別，以期為今后動(dòng)物園進(jìn)一步開(kāi)展金剛鸚鵡的飼養(yǎng)管理、繁殖育種及物種保護(hù)奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集。

采集上海動(dòng)物園內(nèi)正常飼養(yǎng)的36只金剛鸚鵡的羽毛，其中藍(lán)黃金剛鸚鵡27只，紅綠金剛鸚鵡9只。采集樣品均為鳥(niǎo)類(lèi)胸部羽毛，確保羽根完整，常溫干燥保存或-80 ℃下長(zhǎng)期冷凍保存。

1.1.2 主要試驗(yàn)設(shè)備與試劑。

主要試驗(yàn)設(shè)備有凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 1600）、PCR儀（Jena Biometra TRIO）、電泳儀（Tanon EPS 300）、電泳槽、移液槍?zhuān)‥ppendorf）等。

主要試劑：MightyAmpTM DNA Polymerase Ver.3 Kit、50 bp DNA Ladder Marker、6× Loading Buffer均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。引物2550 F（5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′）和 2718R（5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′）[7]由英濰捷基公司合成。

1.2 PCR反應(yīng)

應(yīng)用引物2550F和2817R對(duì)CHD基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20 μL，各組分濃度按試劑盒推薦體系設(shè)置，其中樣本DNA剪取1 mm長(zhǎng)2～3段羽根，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。退火溫度為48 ℃，PCR反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行。

1.3 瓊脂糖凝膠電泳

1.3.1 瓊脂糖凝膠的制備。

瓊脂糖凝膠濃度為1.5%，用電子天平稱(chēng)取瓊脂糖4.5 g，加入錐形瓶中，添加30 mL 1×TAE后將錐形瓶置于微波爐中加熱，沸騰直至瓊脂糖完全溶解。用流水將錐形瓶中液體冷卻至50～60 ℃，加入EB染料4 μL，混勻，倒入凝膠模具中，室溫放置30 min以上，備用。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中添加6×Loading Buffer 2～3 μL，混勻后取10 μL上樣，在1.5%的瓊脂糖凝膠上120 V穩(wěn)壓，電泳35 min，電泳完畢后，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照并記錄結(jié)果。產(chǎn)物為1條條帶的為雄性個(gè)體，產(chǎn)物為2條條帶的為雌性個(gè)體，電泳產(chǎn)物由寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 羽根樣品PCR檢測(cè)及方法的有效性驗(yàn)證

以已知性別的藍(lán)黃金剛鸚鵡和紅綠金剛鸚鵡為例，分別以血液抽提的DNA和羽根樣品為模板，利用2550F/2718R引物擴(kuò)增金剛鸚鵡的CHD基因片段，驗(yàn)證以羽根為樣品直接進(jìn)行PCR檢測(cè)的有效性和可靠性。

如圖1所示，2種金剛鸚鵡的雄性個(gè)體均擴(kuò)增出1條條帶，經(jīng)克隆測(cè)序與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄序列比對(duì)，大小為647 bp;雌性個(gè)體均擴(kuò)增出2條條帶，一條為630 bp，另一條為411 bp。2種金剛鸚鵡血液組DNA與羽根樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果相一致，且與已知性別結(jié)果相吻合。從電泳結(jié)果來(lái)看，以未經(jīng)核酸提取純化的羽根為模板擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物條帶清晰度和產(chǎn)物濃度與血液組DNA相比無(wú)明顯差異，也無(wú)明顯非特異性擴(kuò)增，可用于該種金剛鸚鵡的性別鑒定。

2.2 金剛鸚鵡的性別鑒定

利用引物2550F /2718R對(duì)金剛鸚鵡種群中未知性別的個(gè)體進(jìn)行性別鑒定，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，條帶大小與已知性別條帶大小相同，準(zhǔn)確率達(dá)100%。紅綠金剛鸚鵡群體中雌性5只、雄性4只，

雌雄比為5∶4;藍(lán)黃金剛鸚鵡群體中雌性10只、雄性17只，雌雄比為10∶17。

3 討論

世界上鳥(niǎo)類(lèi)資源豐富，且大多為單態(tài)性鳥(niǎo)類(lèi)。金剛鸚鵡羽毛色彩鮮麗，深受人們的喜愛(ài)，但是其性別無(wú)論是幼鳥(niǎo)還是成鳥(niǎo)均很難從外觀判別，種群中性別結(jié)構(gòu)難以判定，給繁殖配對(duì)造成了一定的困擾，也給鳥(niǎo)類(lèi)管理和保護(hù)、鳥(niǎo)類(lèi)生態(tài)學(xué)、行為學(xué)研究等方面帶來(lái)不便，因此鳥(niǎo)類(lèi)的性別鑒定對(duì)于金剛鸚鵡這種珍稀鳥(niǎo)類(lèi)的繁殖育種、保護(hù)研究具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用PCR方法進(jìn)行鳥(niǎo)類(lèi)的性別鑒定已取得突破性進(jìn)展，基于性染色體上特定基因CHD同源拷貝的大小差異，應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定的方法已經(jīng)被應(yīng)用于多種動(dòng)物保護(hù)繁育的研究中。

Griffiths等[8]從小藍(lán)金剛鸚鵡的羽毛中提取DNA，并利用引物（P1、P2、P3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合限制性?xún)?nèi)切酶DdeI對(duì)其進(jìn)行性別鑒定，但其花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。Cerit等[9]利用引物P2/P8對(duì)雞尾鸚鵡進(jìn)行了性別鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P2/P8引物對(duì)于一些目的片段相近的條帶難以區(qū)分，亦需要通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶來(lái)分離目的條帶，過(guò)程比較煩瑣。胡銳穎等[10]、田秀華等[11]應(yīng)用引物2550F /2718R對(duì)大多數(shù)鶴形目、鸛形目鳥(niǎo)類(lèi)進(jìn)行了性別鑒定，目前尚未見(jiàn)到將該引物應(yīng)用于鸚形目鳥(niǎo)類(lèi)金剛鸚鵡的相關(guān)報(bào)道。

該研究應(yīng)用2550F /2718R引物對(duì)金剛鸚鵡羽毛樣本的CHD-W基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采集樣本為非侵入性且不需麻醉即可獲得的羽毛，尤其針對(duì)金剛鸚鵡這種珍稀鳥(niǎo)類(lèi)更應(yīng)避免和減少對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)的損傷和應(yīng)激，且羽毛樣本采集、保存和運(yùn)輸?shù)榷际址奖悖Y(jié)合分子生物學(xué)快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，簡(jiǎn)化了DNA提取的步驟，使得性別鑒定用時(shí)更少，鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確可靠，效率更高，有很好的可靠性，為該物種在分子水平上進(jìn)行性別鑒定奠定了基礎(chǔ)[12-13]。

該研究檢測(cè)了上海動(dòng)物園藍(lán)黃金剛鸚鵡和紅綠金剛鸚鵡的群體性別結(jié)構(gòu)，其雌雄比分別為10∶17和5∶4，藍(lán)黃金剛鸚鵡中雄性較多，繁殖配對(duì)難以均衡，種群中雄性過(guò)多也容易引發(fā)打斗，尤其是繁殖季節(jié)容易造成外傷、應(yīng)激等不利影響，在一定程度上不利于種群發(fā)展，建議優(yōu)化雌雄比，因?yàn)檩^高的雌性比例更有利于提高種群的繁殖潛力。

參考文獻(xiàn)

[1] ITO H，SUDO-YAMAJI A，ABE M，et al.Sex identification by alternative polymerase chain reaction methods in Falconiformes[J].Zoological science，2003，20（3）：339-344.

[2] JENSEN T，PERNASETTI F M，DURRANT B.Conditions for rapid sex determination in 47 avian species by PCR of genomic DNA from blood，shell-membrane blood vessels，and feathers [J].Zoo biology，2003，22（6）：561-571.

[3] GRIFFITHS R，DOUBLE M C，ORR K，et al.A DNA test to sex most birds[J].Molecular ecology，1998，7（8）：1071-1075.

[4] 吳建民，梁靚，王建發(fā)，等.鸚鵡性別鑒定方法的研究進(jìn)展[J].畜牧與飼料科學(xué)，2018，39（12）：37-40.

[5] 劉鑄，白素英，田秀華.CHD基因與非平胸鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定[J].生物技術(shù)通報(bào)，2006（S1）：147-150.

[6] 包文斌，胡飛，徐琪，等.鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定的分子生物學(xué)方法[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2007，34（10）：33-36.

[7] FRIDOLFSSON A K，ELLEGREN H.A simple and universal method for molecular sexing of non-ratite birds[J].Journal of avian biology，1999，30（1）：116-121.

[8] GRIFFITHS R，TIWARI B.Sex of the last wild spix’s macow[J].Nature，1995，375：454.

[9] CERIT H，AVANUS K.Sex identification in avian species using DNA typing methods[J].World’s poultry science journal，2007，63（1）：91-100.

[10] 胡銳穎，耿昕，馬珺，等.一種簡(jiǎn)單通用的鳥(niǎo)類(lèi)性別分子鑒定技術(shù)（簡(jiǎn)報(bào)）[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，2003，36（5）：401-404.

[11] 田秀華，劉鑄，何相寶，等.7種鶴形目鳥(niǎo)類(lèi)性別的分子鑒定[J].動(dòng)物學(xué)雜志，2006，41（5）：62-67.

[12] BELLO N，F(xiàn)RANCINO O，SNCHEZ A.Isolation of genomic DNA from feathers[J].Journal of veterinary diagnostic investigation，2001，13（2）：162-164.

[13] SEGELBACHER G.Noninvasive genetic analysis in birds：Testing reliability of feather samples[J].Molecular ecology notes，2002，2（3）：367-369.