宏基因組在動物腸道微生物中的應用研究進展

余歡 李輝

摘要 腸道微生物與機體之間始終保持著一種動態平衡的關系，它們不僅在機體的消化吸收方面發揮作用，而且在機體免疫、營養物質代謝等方面起著重要調節作用。近年來，隨著宏基因組研究的快速發展，人們利用宏基因組在動物腸道菌群上進行了廣泛研究，腸道微生物菌群結構及其在生理代謝途徑中發揮的作用在此基礎上得到了更全面的認識。綜述宏基因組在腸道微生物方面的研究進展，旨在為動物生產相關領域的研究提供參考。

關鍵詞 宏基因組;腸道微生物;全基因組測序;16S rRNA

中圖分類號 S852.6? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）01-0018-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.005

Research Progress in the Application of Metagenomics in Animal Gut Microbes

YU Huan1，2，LI Hui1，2

（1.Key Laboratory of Plateau Mountain Animal Genetics， Breeding and Propagation， Ministry of Education， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025; 2. College of Animal Science， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025）

Abstract There is always a dynamic balance between intestinal microorganisms and the body. They not only play a role in digestion and absorption， but also play an important regulatory role in immunity， nutrient metabolism and other aspects of the body. In recent years， with the rapid development of the research on metasomes， people have conducted extensive researches on the intestinal flora of animals by using metasomes， on the basis of which the structure of intestinal microflora and the role they play in physiological metabolic pathways have been more comprehensively understood. Review the research progress of metagenomics in intestinal microorganisms， aiming to provide reference for the research in the field of animal production.

Key words Metagenomics;Intestinal microorganisms;Whole genome sequencing;16S rRNA

基金項目 貴州省科技支撐計劃項目（黔科合支撐〔2019〕2285號）;貴州省地方家禽產業聯合攻關項目（黔財農〔2020〕175號）。

作者簡介 余歡（1996—），女，四川自貢人，碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。

通信作者，教授，博士，從事種質資源保護與利用研究。

收稿日期 2021-04-11

微生物廣泛存在于自然界中，腸道微生物在動物機體整個生長發育過程中發揮著重要作用，其最重要的代謝功能就是對動物自身不能利用的碳水化合物進行酵解，提高養分的利用率，從而滿足機體的生長及繁殖。機體對難以消化的糖類如麥芽糊精等的利用就是通過腸道微生物的作用實現的[1]。除此之外，腸道內的微生物菌群在機體的生理、免疫和營養狀況等方面也發揮著作用[2]。相較于傳統的微生物分離培養技術，用宏基因組學技術研究腸道微生物，不僅大大提升了人們對腸道微生物的了解，而且能夠更快速、客觀、全面地檢測菌群種類與結構組成。因而，越來越多的學者采用宏基因組的方法進行腸道微生物的研究。

腸道微生物有著數目龐大、種群繁多、分類復雜的顯著特點。采用宏基因組的手段對腸道微生物進行研究能夠更全面地認識動物微生物群的種類和結構功能，探索飼糧的變化與動物腸道微生物之間的關系，能夠更客觀全面地認識動物的消化機理，在預防與治療腸道疾病或者與微生物菌群變化有關的疾病時提供相應的理論支持等。

1 宏基因組的概念

宏基因組學（metagenomics）是以特定環境里包含的所有微生物的基因為研究對象，把微生物菌群的數量結構及功能和外部環境存在的關系作為研究目的的一種微生物研究手段。Handelsman等[3]在1998年把宏基因組解釋為：環境中一切微生物的總和，包括特定環境中可培養與不可培養的所有微生物基因，主要為特定環境中真菌和細菌基因組的總和。

2 宏基因組技術

宏基因組技術流程主要有4個步驟：①特定環境中樣品基因的富集處理;②提取樣品中的DNA;③宏基因組文庫的構建與篩選;④目的克隆基因的檢測。其中宏基因組文庫的構建與篩選是技術流程的關鍵點。宏基因組文庫的構建就是在分子克隆原理和技術的基礎上，通過原位裂解法或異位裂解法盡可能多地提取出樣品中全部的DNA，為了獲得完整的目的基因或者基因簇，在對樣品DNA進行提取時保持較大片段的完整性[4]。文庫的篩選包括：①基于功能篩選，就是根據克隆產生的新生物，對其進行活性的篩選。Tyson等[5]在研究小鼠的腸道微生物時篩選出了一種新的非培養微生物基因，基于此試驗，β-葡聚糖酶的活性克隆被發現。②基于序列篩選，是對已知功能的基因進行探針設計或者PCR引物設計，然后對該基因進行雜交或者PCR擴增篩選陽性克隆。③化合物結構篩選，是在宿主細胞進行轉入以及未轉入外源基因或發酵液、提取液的色譜圖比較的基礎上進行篩選。④底物誘導基因表達篩選，是在底物誘導克隆子分解代謝基因的基礎上進行篩選[6]。

3 宏基因組測序方法

宏基因組樣本測序方法包括全基因組測序（de novo 測序）和擴增子測序，其中全基因組測序是基于由高通量測序技術提取環境樣品微生物DNA片段的序列信息，從而評估腸道菌群的組成以及功能[7]，主要用于基因識別、基因代謝通路分析、環境分類分析等[8]，它在研究微生物分子進化、基因組成、基因調控等方面有著重要意義。擴增子測序或稱標簽序列，是對一些在進化中有著高保守、短序列的基因序列進行微生物群落多樣性的系統發育關系等方面的分析[9]。擴增子測序主要采用的是16S rRNA基因序列[10]，選擇16S rRNA 一方面因為它在細菌RNA中占比80%以上，另一方面因為與16S rRNA相比，5S rRNA有較短的序列，23S rRNA 有較快的堿基突變率，其中18S rRNA是16S rRNA在真核生物中的同源體。

4 腸道微生物的功能

腸道微生物中的細菌數量超過99%，嚴格厭氧菌高達97%，只有3%是需氧菌。腸道微生物參與維持胃腸道微生態動態平衡，調節宿主的能量儲存與代謝[11]，激活腸道免疫系統與機體相互作用[12]，參與多個代謝途徑的調控，它們不僅在消化、免疫、機體發育等方面起著重要作用，而且在腸道功能和屏障完整性的維持以及繁殖性狀的表現等方面發揮著相應功能[13]，因而被稱為動物的“第二基因組”。

腸道微生物在不同個體之間的群落組成不同，即使是同一個體，不同部位的組成也略有差異。飲食、環境、年齡、遺傳等因素都對腸道微生物群落結構有著或多或少的影響。研究發現，人類腸道微生物菌群結構與飲食習慣有很大關系，飲食以碳水化合物為主發現含有較多的普氏桿菌屬，而以高蛋白、高脂肪食物為主發現以擬桿菌屬為主[14-15]。機體通過自身的適應性應答或疾病等方式對環境的改變做出回應，與此同時，腸道內的微生物菌群也會做出相應的變化，用以完成機體對環境的適應性調節[16]。研究表明，隨著年齡的增長，腸道微生物的變化呈現出一定的規律，比如厭氧菌含量呈現出一定量的增加，而雙歧桿菌、乳桿菌和擬桿菌等含量相對減少[17-18]。由腸道微生物產生的短鏈脂肪酸（SCFAs）參與著機體的免疫調節和自身免疫炎癥過程[19]，其途徑主要是激活G蛋白偶聯受體以及抑制組蛋白去乙酰化酶[20];SCFAs通過為腸黏膜細胞提供能量，促進細胞的生長以及代謝，通過降低腸道內環境的pH來減少有害菌，從而維持腸道功能的穩定[21-22]。膽汁酸可以促進腸道對脂質和維生素的消化吸收，在機體免疫方面發揮作用，腸道微生物可以促進初級膽汁酸轉變為次級膽汁酸，進而對體內膽汁酸含量進行調控[23]。

近年來，腸道微生物與一些常見疾病之間的研究也在進行中。研究發現，腸道菌群結構紊亂與兒童孤獨癥有關[24];帕金森病的發病[25]伴隨著腸道微生物群失調;腸道微生物的變化可以IBD的治療起到反饋作用[26];腸道微生物還與肥胖的治療、Ⅱ型糖尿病的治療、癌癥的治療等有著重要關系[27-29]。這些研究表明，腸道微生物菌群的數量與結構對診斷和治療疾病有重要作用。

腸道微生物在腸道甚至整個機體上都起著重要作用，因而了解其群落構成以及功能顯得尤為重要。早期研究腸道微生物的方法是微生物培養，傳統研究是對其進行體外培養，然后對其結構和功能進行研究。然而，只有1%的微生物能夠進行常規分離培養，局限性非常大，能夠進行體外培養的微生物只占微生物總量的很少一部分。在宏基因組手段的幫助下，避開了對微生物菌種進行純培養的障礙，直接從自然界獲取遺傳信息、活性物質和功能基因，技術上比用純分離培養法有了很大的進步，大大縮短了時間，能夠更清晰地認識微生物的結構和功能，拓寬了微生物資源的利用空間。

在腸道微生物基因集構建方面，從2010年起人、鼠和豬的腸道微生物參考基因集就已經被構建出來[30-33]。近年關于雞的腸道微生物基因集構建有了重大進展，張艷[34]獲得了雞的十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結直腸等的首個腸道微生物宏基因集，并對相關基因序列進行了功能注釋。王恒超[35]構建了第一個完善的雞腸道微生物的基因集。人類及部分動物的腸道微生物基因集的構建，能夠幫助人們定位微生物、監測人類及動物的健康狀態，在疾病的治療方面也可以發揮重要作用。

5 宏基因組在動物腸道微生物的應用研究

動物的品種、生長階段、飼料、腸道段落等與腸道微生物多樣性的變化都有關聯。Yang 等[36]研究發現，動物品種與腸道微生物區系組成有關，不同豬種的腸道微生物組成也不相同。Kim等[37]研究發現，動物不同生長階段的腸道微生物組成也各不相同。張輝等[38]通過對不同處理組中梅花鹿的瘤胃液樣品進行宏基因組測序，結果顯示，飼喂粗纖維較多的玉米秸葉，優勢菌群為能降解纖維的瘤胃球菌屬和纖維桿菌屬;飼喂含碳水化合物較多的柞樹葉時，普雷沃菌屬等為優勢菌群，表明飼喂柞樹葉更能促進新陳代謝，更適合東北梅花鹿營養需求以及瘤胃微生物的繁殖和生長。溫康等[39]通過對朗德鵝的腸道微生物進行16S rRNA測序，發現填飼組朗德鵝的空腸和回腸中的厚壁菌門以及放線菌門的相對豐度明顯增加，其中放線菌門數量的增加可能和鵝肥肝不發生病變有關系。Danzeisen等[40]研究發現，在日糧中添加莫能霉素可減少雞回腸中氏菌屬（Roseburia）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus），增加糞球菌屬（Coprococcus）、還原菌屬（Anaerofilum）以及硫酸鹽，在同時添加威里霉素或泰樂菌素的對照組中，出現大量埃希氏菌屬（Escherichia coil）。譚振[41]證實在飼料效率存在差異的情況下，相同豬種的糞便及腸道各段微生物之間存在差異，回腸中的優勢菌屬是厭氧桿菌屬（Anaerobacter）和Turicibacter，而在結腸中普氏菌屬（Prevotalla）、顫桿菌克（Oscillibacter）和琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）則相對更加富集，表明高低飼料效率組在盲腸位置上差異的通路主要與丙酮酸相關代謝途徑有關，結腸微生物差異與多個參與到輔酶因子和維生素代謝有關。

通過對腸道微生物菌群的變化進行測定，可以探究不同飼料對動物生長發育的影響。張孟陽等[42]用16S rRNA測序手段對海蘭褐蛋仔雞進行分析，得出結論如下：發酵飼料可使仔雞腸道脫硫弧菌屬的相對豐度降低，在腸道疾病方面起到預防的作用;厚壁菌門的相對豐度增加可促進仔雞生長發育。

同種動物在不同環境中長大，其腸道微生物菌群也不相同;相同環境下，對動物采取不一樣的處理其腸道微生物菌群也不一樣。在宏基因組的幫助下，可以對菌群的變化進行直觀分析，判斷這些改變是否對動物有益、能否在生產實踐上進行利用。在常規環境下長大的新西蘭兔腸道微生物多樣性顯著高于同一批成長于SPF（specific pathogen free）環境下的新西蘭兔，其中常規環境組的厚壁菌門顯著高于SPF組，由厚壁菌門產生的SCFAs會對其免疫力起到增強作用[43]。對新西蘭白兔采取禁食軟糞的措施，會影響到其腸道發育以及腸道微生物的多樣性，這可能與擬桿菌屬的增加以及瘤胃球菌屬減少有關，此外還發現了顫桿菌克（Oscillibacter）與Akkermansia菌屬可能對新西蘭兔的體重和脂質代謝有調節作用[44]。通過對不同飼養環境下的黑葉猴腸道菌群進行研究，發現厚壁菌門和擬桿菌門能夠在纖維物質消化方面起作用，梭菌屬、普雷沃氏菌屬在分解纖維素以及碳水化合物的降解方面起到重要作用[45]。這些研究表明了腸道微生物的變化受到多種因素的影響，對腸道微生物的菌群進行調節不僅可以預防疾病的發生還可以對動物的生長發育進行有效調節，以此滿足生產生活的需求。

6 小結

動物腸道內棲居著豐富的微生物菌群，它們和腸道環境保持著動態平衡，形成一個相對穩定的腸道微生態系統，腸道微生物對宿主的生長和發育發揮著重要作用，影響著機體的健康。目前，腸道微生物菌群的調控已經逐漸應用于人類疾病的預防和治療。但是，關于通過調控腸道微生物來影響動物生產方面的研究鮮有報道，在今后的研究中可以把腸道微生物菌群的結構和功能與動物的生產實踐相聯系，以期開發出新的畜禽飼料，預防畜禽的疾病，促進畜禽的健康養殖，減少因疾病引起的損失等。因此，用宏基因組的方法研究這些菌群有著非常重要的實踐意義。

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