基于網(wǎng)絡藥理學探討荔枝核“異病同治”胃癌和肝癌的作用機制▲

尹碩鑫 盧 鑫 王舒萍 李安過 邱薛竹 李升馳 黃鴻翔 張 濤 陳遠能

(1 廣西中醫(yī)藥大學研究生院，廣西南寧市 530000；2 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院消化內科，廣西南寧市 530011)

胃癌的致病因素復雜，環(huán)境和遺傳因素都可能對其發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生影響[1]。盡管在過去的幾十年里，胃癌的新發(fā)和死亡病例數(shù)均較前減少，但它仍是全球范圍內第5大常見癌癥和第4大常見癌癥死亡原因[1]。近年來，肝癌的病死率超過胃癌，已成為全球范圍第3大癌癥死亡原因[2]。肝癌的發(fā)病危險因素主要有病毒性肝炎、酒精性肝病、代謝性肝病和長期接觸毒素[3]。雖然我國對乙肝和丙肝的防控已經(jīng)使部分地區(qū)的肝癌發(fā)病率明顯降低，但由于人口基數(shù)大，每年新確診的肝癌患者數(shù)量仍居高不下[4]。胃癌和肝癌早期缺乏特異性癥狀，因此多數(shù)患者確診時常已處于癌癥中晚期，常規(guī)西醫(yī)治療效果欠佳。中醫(yī)藥在癌癥的防治中發(fā)揮著至關重要的作用，其能提高西藥的療效，且藥物副作用小，可改善患者生活質量[5-6]。此外，中醫(yī)藥還能延緩癌癥進展的速度、緩解患者的臨床癥狀，從而提高患者5年生存率，如今在胃癌和肝癌治療中的應用也越來越廣泛[7]。

中醫(yī)理論認為胃癌的形成是在素體脾胃虛寒的基礎上，飲食生冷，感受濕熱寒邪，日久郁積引起的氣血運行不暢[8]，最常見的證型為脾氣虛證、肝胃不和證、痰濕證、熱毒證、血虛證、血瘀證等[9]。胃癌的治療原則一般以益氣健脾、活血化瘀、清熱解毒為主[10]。肝癌的病機以正氣不足、痰瘀毒等邪氣內盛為主，治療以扶正祛邪為法[11]。荔枝核為無患子科、亞熱帶常綠喬木荔枝的干燥成熟種子，性溫，味甘、微苦，歸肝、腎經(jīng)，具有行氣散結、祛寒止痛的作用[12]。現(xiàn)代藥理學研究表明，荔枝核提取物的化學成分可通過影響細胞增殖、凋亡、自噬、轉移、血管生成、免疫靶向，以及提高化療和放療敏感性等，從而發(fā)揮抗癌作用[13]。基于中醫(yī)理論的辨證論治，胃癌和肝癌的證型均以痰、瘀、毒為主，治療方案以活血化瘀、化痰散結、解毒等為主，而荔枝核恰可用于行氣散結。因此，本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法，探究荔枝核異病同治胃癌和肝癌的可能性，為荔枝核的臨床應用提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 荔枝核有效化學成分及其作用靶點的篩選 登錄中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，以“荔枝核”為關鍵詞，設置篩選標準為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和藥物相似性(drug likeness,DL)≥0.18，檢索荔枝核的有效化學成分。再利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺檢索有效化學成分對應的作用靶點。最后在UniProt 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中，將限定物種設置為人類，將所有靶點名稱轉換為標準基因名。

1.2 荔枝核治療胃癌和肝癌的共同靶點獲取 以“gastric cancer”和“l(fā)iver cancer” 為關鍵詞，在GeneCards?數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和OMIM?數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)中檢索胃癌和肝癌相關靶點，然后設置“Relevancescore≥15”進行篩選；將最終篩選得到的靶點導入 Excel 表格中進行標準化處理，包括刪除重復靶點等。使用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)將荔枝核有效化學成分的作用靶點與胃癌和肝癌相關靶點取交集，即為荔枝核治療胃癌和肝癌的共同靶點，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將共同靶點名稱轉換為標準基因名。

1.3 “中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡和“中藥-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡的構建 將篩選得到的荔枝核有效化學成分及其作用靶點信息導入 CytoScape 3.7.2軟件構建荔枝核“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡圖。再將共同靶點信息導入CytoScape 3.7.2 軟件繪制荔枝核治療胃癌和肝癌的“中藥-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡的構建 將荔枝核治療胃癌和肝癌的共同靶點導入STRING平臺(https://string-db.org/，version 11.0)，限定物種設置為人類，并設置互相作用平分相關度≥0.40，隱藏游離節(jié)點，不另外擴充互動靶點，利用CytoScape 3.7.2軟件制作蛋白質-蛋白質互相作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡圖。在CytoScape 3.7.2軟件中點擊CytoHubba并選擇degree(即度值)，篩選排名前20的核心靶點，并采用相同的方法重新構建核心靶點的PPI網(wǎng)絡。

1.5 共同靶點的功能富集和通路富集分析 將共同靶點上傳至 Metascape平臺(http://metascape.org/)，限定物種設置為人類，進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。設定P<0.01為篩選條件，再根據(jù)-LgP值對富集分析結果進行由大到小排序，選取排名前10的條目，再利用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行可視化處理。

2 結 果

2.1 荔枝核的有效化學成分及其作用靶點 共獲得荔枝核有效化學成分8個(見表1)，以及有效化學成分對應的作用靶點179個。通過CytoScape 3.7.2軟件構建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡由188個節(jié)點、222條邊組成，見圖1。

表1 荔枝核有效化學成分的基本信息

圖1 “中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡

2.2 荔枝核治療胃癌和肝癌的共同靶點 分別得到胃癌和肝癌相關靶點1 177個、1 281個；將兩者與荔枝核有效化學成分的作用靶點取交集，得到共同靶點61個，即為荔枝核治療肝癌和胃癌的共同靶點(見圖2)。通過 CytoScape 3.7.2 軟件繪制“中藥-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡，見圖3。

圖2 荔枝核有效化學成分的作用靶點與胃癌和肝癌相關靶點的韋恩圖

圖3 “中藥-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡

2.3 共同靶點的PPI網(wǎng)絡 荔枝核治療胃癌和肝癌的共同靶點的PPI網(wǎng)絡由58個節(jié)點、699條邊組成，節(jié)點平均度值為23.3，節(jié)點平均介數(shù)中心性為0.696，見圖4。根據(jù)網(wǎng)絡節(jié)點的度值篩選出核心靶點20個，構建核心靶點的PPI網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡由20個節(jié)點、103條邊組成，核心靶點包括 MYC原癌基因(MYC proto-oncogene,MYC)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、細胞周期蛋白1(cyclin D1)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、Caspase-3、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)A、缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)1A、Erb-B2受體酪氨酸激酶(Erb-B2 receptor tyrosine kinase,ERBB)2、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)、前列腺素內過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)1、Fos原癌基因(Fos proto-oncogene,FOS)、孕酮受體(progesterone receptor，PGR)、Caspase-8、過氧化物酶體增生激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARG)、雄激素受體(androgen receptor，AR)、MAPK8、B細胞κ輕肽基因增強子核因子抑制因子(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor alpha，NFKBIA)、網(wǎng)狀內皮細胞過多癥病毒癌基因同源物A(reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA)、Caspase-9，見圖5。

圖4 荔枝核治療胃癌和肝癌的共同靶點的PPI網(wǎng)絡

圖5 荔枝核治療胃癌和肝癌的核心靶點的PPI網(wǎng)絡

2.4 GO功能富集分析結果 61個共同靶點共涉及3 588個生物過程，442個分子功能，以及281個細胞組分，各選取-LgP值排名前10的條目進行可視化分析，見表2。涉及的生物過程主要有凋亡信號通路、對無機物質的反應、細胞死亡正調控、上皮細胞增殖等；涉及的細胞組分主要有膜筏、囊泡腔、受體復合物等；涉及的分子功能主要有激酶結合、DNA結合轉錄因子結合、蛋白激酶活性等。見圖6。

圖6 GO功能富集分析柱狀圖

表2 GO功能富集分析結果

2.5 KEGG通路富集分析結果 61個共同靶點共富集 333 條信號通路(均P<0.01)，根據(jù)-LgP值大小篩選排名前10的主要通路，見表3及圖7。

表3 KEGG通路富集分析結果

圖7 KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討 論

本文采用網(wǎng)絡藥理學對荔枝核異病同治胃癌和肝癌的有效化學成分及其作用機制進行研究，篩選出荔枝核有效化學成分8個，包括表兒茶素、槲皮素、豆甾醇、甘露醇、β-谷甾醇、谷甾醇、油酸乙酯、油酸丁酯。其中槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，體內和體外實驗均表明槲皮素可通過介導多個信號通路抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、抑制血管生成、改變細胞周期、影響自噬等，具有抗腫瘤作用，涉及的信號通路包括磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、Wnt/β-catenin、MAPK/細胞外信號調節(jié)激酶1/2等[14-15]。此外，其余幾種有效化學成分也被證明具有預防癌癥的作用[16-17]。

本研究結果顯示，荔枝核治療胃癌、肝癌的共同靶點有61個，進一步篩選獲得核心靶點20個，即MYC、ESR1、cyclin D1、EGFR、Caspase-3、VEGFA、HIF1A、ERBB2、IL-6、PTGS2、MAPK1、FOS、PGR、Caspase-8、PPARG、AR、MAPK8、NFKBIA、RELA、Caspase-9。研究顯示，ESR陽性的胃癌患者，其3年生存率高于ESR陰性患者，提示ESR可能抑制胃癌的侵襲[18]。MYC可通過調控關鍵細胞的基因功能，如DNA代謝動力學，細胞周期、凋亡、黏附、存活，以及蛋白質和大分子合成，在腫瘤的進展中發(fā)揮重要作用[19]。MYC的活化可促進腫瘤的發(fā)生，上調MYC能夠促進胃癌患者的局部或遠處轉移[20]。EGFR屬于酪氨酸激酶受體ERBB家族成員，EGFR信號級聯(lián)是細胞增殖、分化、分裂、存活和癌癥發(fā)展的關鍵調控因素[21]。有研究表明,EGFR通過激活MAPK信號通路、信號轉導子和轉錄激活因子5、Ras-Raf-MEK信號通路，來促進胃癌惡化[22]。細胞周期蛋白是同源細胞周期依賴性激酶的變構激活劑，它們的水平通常在細胞周期中呈波動狀態(tài)，當cyclin D1過表達時細胞周期依賴性激酶活性失調，導致在有絲分裂信號受限的條件下細胞快速生長，繞過關鍵的細胞檢查點，最終導致腫瘤生長[23]。研究表明，沉默cyclin D1可抑制肝癌細胞的分化并且能夠改善肝癌對5-氟尿嘧啶的耐藥性[24]。研究表明，Caspase-3的失調可介導胃癌和肝癌的發(fā)生和發(fā)展[25-26]。這些研究均提示ESR1、MYC、EGFR、Cyclin D1等靶點與胃癌和肝癌關系密切，而荔枝核可能是通過作用于這些靶點起到治療胃癌和肝癌的作用。

本研究GO功能富集分析結果顯示，荔枝核治療胃癌和肝癌涉及的生物過程主要有凋亡信號通路、對無機物質的反應、細胞死亡正調控、上皮細胞增殖等；涉及的細胞組分主要有膜筏、囊泡腔、受體復合物等；涉及的分子功能主要有激酶結合、DNA結合轉錄因子結合、蛋白激酶活性等。細胞凋亡是一種細胞程序，受到基因的精細調控[27]。細胞凋亡異常被認為是癌癥的特征之一[28]。細胞凋亡異常不僅與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關，而且與腫瘤的耐藥性有關[29]。膜筏是細胞膜的分子結構，在維持細胞膜屏障功能和流動性方面起著重要作用。膜筏可通過控制癌細胞的信號轉導功能，調控多種生物過程，如生長、增殖、遷移、侵襲或轉移[30]。細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由細胞主動釋放的納米囊泡，其在許多生理和病理過程中發(fā)揮介導細胞間信息交流的作用[31]。研究顯示，與正常細胞相比，癌細胞富集大量EVs，EVs有助于研究腫瘤發(fā)生的潛在機制和生物分子基礎[32]。本研究KEGG通路富集分析結果顯示，荔枝核治療胃癌和肝癌主要涉及的通路有癌癥相關通路、癌癥中的蛋白聚糖、VEGF信號通路、HIF-1信號通路等。這些通路可能在荔枝核異病同治胃癌和肝癌中發(fā)揮著重要作用。細胞外基質失調可以為腫瘤細胞提供有利的生存條件，從而導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。而蛋白聚糖是構成細胞外基質的主要大分子，也是細胞外基質的主要組成部分，在維持組織內環(huán)境穩(wěn)定中起著重要的生理作用。蛋白聚糖通過與細胞外基質中的各種細胞因子、生長因子、細胞表面受體、黏附分子、酶和糖蛋白直接或間接相互作用，影響細胞行為和基質特性，從而在腫瘤的血管生成、增殖、侵襲和轉移中發(fā)揮著重要作用[33-34]。已有研究表明，蛋白聚糖在胃癌和肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[35-36]。VEGF在病理條件下通過調節(jié)血管生成促進腫瘤的生成[37]。研究表明，通過抑制VEGF通路可起到抑制胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用[38]。另一項研究表明，miR-26b通過PI3K/AKT和核因子κB/MMP-9/VEGF途徑抑制人肝癌細胞增殖[39]。此外，還有多項研究證實了VEGF的失調在胃癌和肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[40-42]。結合本研究富集分析結果，我們推測荔枝核可能通過干預癌癥相關通路、VEGF信號通路等途徑發(fā)揮治療胃癌和肝癌的作用。

綜上所述，荔枝核主要通過調節(jié)凋亡信號通路等生物過程，作用于膜筏、囊泡腔等細胞組分，進而實現(xiàn)激酶結合、DNA結合轉錄因子結合等分子功能，以及調控癌癥相關通路、VEGF信號通路、HIF-1信號通路等，最終起到防治胃癌和肝癌的作用。本文以中醫(yī)藥理論為依據(jù)，通過網(wǎng)絡藥理學分析荔枝核異病同治胃癌和肝癌的可能機制，推斷可能成為靶向治療的潛在靶點，這為胃癌和肝癌的臨床診斷和個體化用藥提供指導，為后期進一步研究開發(fā)荔枝核配伍治療提供了新思路。