青少年2型糖尿病人群代謝相關脂肪性肝病與腸道菌群的相關性研究

陳思劼，蔡舒婷，徐靜，陳雅娟，陳斌斌，陳曉莉，熊紅萍，2

1.廈門大學附屬福州第二醫院內分泌科，福建福州 350007；2.福建醫科大學第三臨床醫學院，福建福州 350007；3.福建中醫藥大學第一臨床醫學院，福建福州 350122

代謝相關脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease, MAFLD）是一種遺傳易感、環境因素和代謝紊亂相互作用導致的慢性肝病，其患病率逐年上升，累及全球約25%的人口[1]。糖代謝紊亂、胰島素抵抗、內臟型肥胖等代謝因素被認為是與MAFLD 關系最為密切的危險因素，同時也是2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）的臨床特征，故MAFLD 與T2DM 共病率較高。研究顯示，在全球T2DM 人群中MAFLD 的患病率高達47.3%～63.7%[2]。腸道菌群能夠參與動態調節人體能量穩態和免疫反應。當遺傳、環境因素、飲食和行為模式發生改變后，人體內腸道菌群可能發生漂移。近年來不斷有研究發現T2DM 和NAFLD 患者伴有腸道菌群漂移表現[3]。青少年T2DM 中合并MAFLD的患者逐年增多，但這部分人群的腸道菌群漂移特點尚未明確。因此，本研究回顧性選取2020年10月—2021年7月就診于廈門大學附屬福州第二醫院內分泌科并接受肝臟彩超的青少年2 型糖尿病患者44 例為研究對象，按照是否合并代謝相關脂肪性肝病分為非MAFLD 組和MAFLD 組，比較兩組人群的腸道菌群，旨在探討青少年T2DM 人群中MAFLD 與腸道菌群數量的關系。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取于本院內分泌科接受肝臟彩超的青少年2型糖尿病患者44 例為研究對象，根據MAFLD 診斷標準[1]，將其中不符合MAFLD 診斷的18 例患者設為非MAFLD 組，符合MAFLD 診斷的26 例患者設為MAFLD 組。本研究經本院倫理委員會批準（No.2020018），所有對象均知情同意。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①符合《中國2 型糖尿病防治指南（2020年版）》[4]的診斷及分型標準；②年齡14～40歲，性別不限；③臨床資料完整，知情同意。

排除標準：①妊娠或哺乳期女性；②糖尿病酮癥酸中毒、高滲性昏迷等急性并發癥患者；③急、慢性感染患者；④急性心臟、肝臟、胃腸道、腎臟及腦血管病變患者；⑤半年以內嚴重外傷、手術者；⑥惡性腫瘤、臨床結締組織疾病等患者；⑦其他嚴重內分泌代謝性疾病患者（如甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能減退、庫欣綜合征等）。

1.3 方法

所有患者就診時采集其清晨糞便樣本，將新鮮糞便樣本（10±5） g 于2 h 內速凍于-80℃冰箱中。采用QIAamp DNA Stool Mini Kit 試劑盒進行基因組抽提樣本中微生物的總DNA，將所提取的DNA 為模板，根據菌群16 S rRNA V4V5 序列設計各類菌種特異性引物，引物序列見表1。采用FTC-3000 熒光定量PCR 儀（加拿大Funglyn Biotech 公司）對腸道中常見幾種細菌進行定量測定，反應條件：95℃預變性30 s，在95℃變性10 s，55℃退火 30 s，72℃延伸30 s，循環40 次。熒光數據采集在延伸時進行。每個糞便標本均測量3 次，取平均CT 值，根據標準曲線計算該菌屬基因拷貝數，并經Log10 轉化后表示每克糞便腸道菌屬的數量。

表1 各類菌種特異性引物序列

收集所有患者：①人體學指標：身高、體質量、腹圍，計算身體質量指數（body mass index, BMI）=體質量/身高2（kg/m2）；②生化代謝指標：空腹血糖（fasting plasma glucose, FPG）、餐后2 h 血糖（2 h postprandial plasma glucose, 2 hPG）、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin, HbA1c）、三酰甘油（triglycerides, TG）、總膽固醇thosetotal cholesterol, TC）、高密度脂蛋白膽固醇（thosehigh-density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、尿 酸（serum uric acid, SUA）、肌酐；③炎癥指標：中性粒細胞淋巴細胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR)、血小板淋巴細胞比值（platelet-lymphocyte ratio, PLR）；④甲狀腺功能：促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）、游離三碘甲狀原氨酸（free triiodothyronine, FT3）、游離甲狀腺激素（free thyroxine, FT4），通過問卷收集吸煙史、飲酒史、糖尿病家族史。

1.4 觀察指標

①對比兩組一般資料、人體學指標、生化代謝指標、炎癥指標及甲狀腺功能水平；②對比兩組腸道主要菌群數量；③腸道菌群與相關臨床指標的相關分析；④腸道菌群與MAFLD 的相關性分析。

1.5 統計方法

采用SPSS 24.0 統計學軟件進行分析數據。使用Shapiro–Wilk 檢驗進行正態性檢驗，符合正態分布的計量資料采用（±s）表示，組間差異比較進行t檢驗；計數資料采用率（%）表示，組間差異比較進行單因素ANOVA 檢驗分析或χ2檢驗分析。采用Pearson 相關性分析進行腸道菌群與人體學指標、糖脂代謝指標等相關性分析。采用Logistics 回歸分析青少年T2DM 患MAFLD 的獨立危險因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料、人體學指標、生化代謝指標、炎性指標及甲狀腺功能比較

兩組性別、飲酒史、糖尿病家族史比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；MAFLD 組年齡較非MAFLD組小，差異有統計學意義（P＜0.05）。人體學指標方面，MAFLD 組BMI、腹圍均大于非MAFLD 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。生化代謝指標方面，MAFLD 組HDL-C 低于非MAFLD 組，血尿酸水平高于 非MAFLD 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；MAFLD 組FPG 及2 hPG 水平均高于非MAFLD 組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組NLR、PLR 比較，差異無統計學意義（P＞0.05），MAFLD 組TSH 水平高于非MAFLD 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組一般資料、人體學指標、生化代謝指標、炎性指標及甲狀腺功能比較

2.2 兩組腸道主要菌群數量比較

MAFLD 組的柔嫩梭菌屬和雙歧桿菌屬數量明顯均低于非MAFLD 組，腸球菌屬和乳酸菌屬數量明顯均高于非MAFLD 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組腸道主要菌群數量對比 (±s)

表3 兩組腸道主要菌群數量對比 (±s)

菌群菌群總量（16S V4V5）腸球菌屬大腸桿菌屬厚壁菌門擬桿菌屬柔嫩梭菌屬乳酸菌屬雙歧桿菌非MAFLD 組（n=18）11.158±0.339 6.681±0.854 8.112±0.882 10.234±0.324 10.259±0.465 9.448±0.739 6.514±1.032 7.354±1.134 MAFLD 組（n=26）11.052±0.364 7.268±1.014 7.854±1.248 10.038±0.546 9.872±0.907 8.764±0.687 7.106±0.700 6.513±0.753 t 值0.978-2.007 0.755 1.363 1.662 3.145-2.267 2.960 P 值0.334 0.045 0.455 0.180 0.104 0.003 0.043 0.010

2.3 腸道菌群與代謝相關臨床指標的關系

將兩組間有統計學差異的腸道菌群與代謝相關臨床指標行Pearson 相關性分析。結果顯示，腸球菌屬數量與腹圍呈正相關；柔嫩梭菌屬數量與腹圍、血尿酸水平、NLR 呈負相關（P＜0.05）；乳酸菌屬數量與腹圍、糖化血紅蛋白、低密度脂蛋白膽固醇呈正相關（P＜0.05）；雙歧桿菌與腹圍、NLR、BMI 呈負相關（P＜0.05）。見表4。

表4 腸道菌群與臨床指標關系

2.4 青少年2 型糖尿病腸道菌群與代謝相關脂肪性肝病的關系

為探究腸道菌群數量與青少年T2DM 發生MAFLD 的相關性，以MAFLD 為因變量，將兩組間有統計學差異的腸道菌群為自變量，逐個納入Logistics 回歸分析。結果提示，柔嫩梭菌、雙歧桿菌數量減少，乳酸菌屬數量增加，青少年T2DM 發生MAFLD 的概率增加。見表5。進一步進行多因素Logistics 回歸分析，在調整了年齡、性別、是否新診斷糖尿病、BMI 后，柔嫩梭菌屬和雙歧桿菌屬仍是青少年T2DM 發生MAFLD 的獨立保護因素（P＜0.05）；即腸道中柔嫩梭菌和雙歧桿菌數量增加，青少年T2DM 發生MAFLD 的概率降低。見表6。

表5 青少年T2DM 腸道菌群數量與MAFLD 關系

表6 影響青少年T2DM 發生MAFLD 多因素分析

3 討論

T2DM 對人體的主要危害在于其長期慢性高血糖狀態對靶器官的損害，其中MAFLD 是T2DM 發生肝臟損害的主要形式[5]。近年來有研究表明，腸道菌群能通過調節宿主能量代謝、改善炎癥反應等方式，參與T2DM、MAFLD 等多種代謝性疾病的發生和發展過程[6-8]。本研究通過比較青少年T2DM 中MAFLD 患者與非MAFLD 患者的臨床特點及腸道菌群的差異，探索青少年T2DM 患者腸道菌群數量與MAFLD 的關系。研究結果表明，柔嫩梭菌屬和雙歧桿菌屬是青少年T2DM 發生MAFLD 的獨立保護因素，且不受年齡、性別、病程和其他混雜因素的影響。

柔嫩梭菌是厚壁菌門的主要成員，是健康人腸道中豐度最高的菌群之一，它的缺失必然引起腸道微生態的紊亂[9]。近年來多項研究表明，柔嫩梭菌對于人體健康的益處來源于其產生的丁酸鹽，它的豐度變化與潰瘍性結腸炎、克羅恩病等腸道炎性疾病密切相關[10]。柔嫩梭菌可在外周血單核細胞中誘導白細胞介素-10(interleukin, IL-10)分泌，后者是一種抗炎細胞因子[11]。Munukka 等[12]的研究表明，與高脂飲食對照小鼠相比，高脂飲食+口服柔嫩梭菌群的小鼠肝臟脂肪含量、天冬氨酸轉氨酶及丙氨酸轉氨酶降低，其機制與內臟脂肪組織中脂聯素表達上調，皮下及內臟脂肪組織對胰島素敏感性增加且炎癥減少相關。此外，本研究還發現，柔嫩梭菌在MAFLD 人群中數量更少，且其與血尿酸及NLR呈負相關，前者可使線粒體發生氧化應激，激活NLRP3 炎癥復合體，加重肝臟炎癥反應及胰島素抵抗，而后者反映機體整體的炎癥狀態，當NLR 增加時，MAFLD 患者發生肝炎和肝纖維化的可能性更大。Martín R 等[13]從健康志愿者的糞便中分離出柔嫩梭菌菌株，通過研究其產物、抗生素耐藥性、免疫調節功能及代謝特征，發現其具有良好的抗炎作用，是下一代益生菌的良好候選者。

雙歧桿菌是目前主要使用的益生菌之一，已經發現并測序出72 種亞種，它們在腸道功能乃至人體穩態方面發揮著重要作用[14]。一項研究通過肥胖并伴有T2DM 患者的十二指腸微生物群進行宏基因組分析，揭示了肥胖、肥胖伴有T2DM 患者，雙歧桿菌屬豐度顯著低于健康個體[15]。另一項研究通過多組學方法，分析4 株人體腸道共生雙歧桿菌（雙歧桿菌PRL2010、青春雙歧桿菌22L、短雙歧桿菌12L、長雙歧桿菌亞種）在小鼠腸道內的相互作用[16]。研究表明，雙歧桿菌之間通過多糖獲取、多糖降解及互養策略在競爭性環境下合作共生，多株雙歧桿菌地引入導致小鼠盲腸菌群組成發生顯著變化，增加了糖降解菌群，如擬桿菌的豐度，從而增強腸道降解植物碳水化合物及宿主多糖的能力。動物研究表明，由乳桿菌與雙歧桿菌聯合的益生菌可以延緩高脂飲食誘導的NAFLD 病變，大鼠的體質量、血清FFA、TG、ALT、IL-1β 和IL-18 水平顯著降低，肝臟和脂肪組織中Gpr109a 的表達顯著降低，丁酸水平顯著增加[17]。上述研究提示，雙歧桿菌與肥胖、低度炎癥、胰島素抵抗和糖代謝紊亂呈負相關。本研究發現MAFLD 患者中雙歧桿菌數量更少，且與腹圍、NLR 呈負相關（P＜0.05），但與糖代謝指標（FPG、2 hPG、HAb1c）無顯著相關性（P＞0.05）。

盡管不是青少年T2DM 患MAFLD 的獨立危險因素，研究觀察到MAFLD 患者中腸球菌和乳酸桿菌的數量更多。腸球菌是檢出率僅次于大腸桿菌的第二大病原菌，當機體大量使用抗生素或免疫力下降時，腸球菌會易位進入其他組織器官，造成機體感染。Llorente C 等[18]的研究基于小鼠模型和人體數據，發現質子泵抑制劑可通過增加腸道腸球菌的數量及促進腸球菌的易位，導致肝臟炎癥及肝細胞死亡。有趣的是，作為益生菌之一，多項研究觀察到，乳酸桿菌與肥胖呈正相關[19-21]。目前也有研究發現乳酸桿菌屬益生菌（如鼠李糖乳桿菌GG）通過與宿主腸道競爭脂肪酸，抑制小鼠腸道中的脂肪酸代謝及吸收，從而抑制肝臟脂肪堆積，以此機制預防脂肪肝的發生[22]。由于乳酸桿菌是T2DM 和MAFLD 患者共有的特征菌群，其對這兩種代謝疾病發揮作用的相關機制還需進一步探討。

另外，本研究發現，盡管在青少年T2DM 中，合并MAFLD 的患者年齡更小[（35.440±7.262）歲 vs（29.150±7.341）歲]（P＜0.05），這可能與青少年T2DM患者存在學習、事業、家庭等多重負擔，生活、飲食、睡眠習慣更差有關，增加了代謝紊亂的風險。雖無統計學差異，本研究發現青少年T2DM 人群中，男性MAFLD 患病率比女性更高。既往研究表明，MAFLD 在男性的患病率高于絕經前女性，而在絕經后相反，可能與體內雌激素水平相關[23]。雌激素可以通過調節情緒和能量穩態、調整脂肪組織功能及分布、抑制炎癥因子生成和改善胰島素抵抗等機制，阻止肝臟的脂肪變性。

本研究還發現甲狀腺功能正常的青少年T2DM患者中，TSH 水平和MAFLD 患病相關。一項橫斷面研究表明，在HbA1c≥7%的T2DM 人群中，TSH 升高不僅與MAFLD 患病率相關，還與MAFLD 脂肪變性程度相關[24]。已有的研究對于TSH 升高導致MAFLD 的機制做了說明：TSH 可作用于激素敏感性三酰甘油脂肪酶和脂肪甘油三酯脂肪酶這兩個脂肪分解的關鍵酶，促進脂肪細胞的分化，從而抑制脂肪組織的分解；此外，TSH 通過調節肝細胞內固醇調節元件結合蛋白-1c(sterol regulatory element binding proteins, SREBP-1c)的表達活性，達到增加三酰甘油合成的目的[25]。

但本研究仍存在一些局限性：①研究樣本數量小，研究結果存在地域限制；②沒有詳細的用藥史，不能排除降糖藥物對腸道菌群的影響；③由于本研究的性質為回顧性分析，腸道菌群與青少年T2DM人群患MAFLD 之間的因果關系尚不能確定。因此，后續可以在大樣本量的基礎上設計多中心前瞻性研究，并在進一步研究中收集可能影響腸道菌群的用藥史。

綜上所述，青少年T2DM 中MAFLD 患者與非MAFLD 患者的腸道菌群存在差異，表現為柔嫩梭菌和雙歧桿菌數量偏低，腸球菌和乳酸桿菌數量偏高。腸道菌群的變化和患者糖脂代謝、肥胖表型、炎癥水平密切相關。在排除了相關混雜因素以后，柔嫩梭菌和雙歧桿菌仍是青少年T2DM 發生MAFLD 的獨立保護因素。這提示調節相應腸道菌群，將有助于青少年T2DM 人群中MAFLD 的防治。