長鏈非編碼RNA MBNL1-AS1對舌鱗狀細胞癌細胞增殖和凋亡的影響

蔣冰坤，李 麗

舌鱗狀細胞癌(TSCC)是最常見的口腔癌類型，占全世界口腔癌的25%～40%[1-2]。由于TSCC的高增殖與高轉移能力，已嚴重威脅人類健康[3]。由于缺乏癌變癥狀，大多數TSCC患者確診時已處于晚期。長鏈非編碼RNA(lncRNA)與癌癥、慢性代謝性疾病、神經退行性疾病、心血管疾病等多種人類疾病密切相關。lncRNA MBNL1-AS1與急性髓系白血病預后相關，其低表達是患者預后不良的獨立因素[4]。在膀胱癌中，lncRNA MBNL1-AS1發揮抑癌作用，其低表達與膀胱癌進展有關[5]。lncRNA MBNL1-AS1可抑制非小細胞肺癌腫瘤干細胞增殖、遷移、侵襲、耐藥和球體形成[6]。但lncRNA MBNL1-AS1在TSCC中的表達及作用未見報道，生物信息學軟件預測顯示lncRNA MBNL1-AS1與miR-503-5p具有結合位點。研究報道，TSCC組織和細胞中miR-503-5p呈高表達，miR-503-5p過表達可逆轉上調lncRNA PART1對TSCC細胞凋亡的促進作用及對細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用[7]。盡管miR-503-5p在TSCC中的作用已有報道，但是lncRNA MBNL1-AS1可否通過調控miR-503-5p表達來影響TSCC進展還尚未可知。故本實驗旨在研究lncRNA MBNL1-AS1能否通過靶向調控miR-503-5p表達來影響TSCC CAL-27細胞增殖和凋亡。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取我院2017年3月—2019年3月30例TSCC的癌組織及癌旁組織，手術切除后立即將樣本保存于-80 ℃環境中。

1.2細胞與試劑 TSCC CAL-27細胞購自上海雅吉生物科技有限公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；Trziol、逆轉錄、qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；MTT試劑購自上海晶抗生物工程有限公司；RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司。

1.3細胞處理與分組 37 ℃、5% CO2條件下，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養CAL-27細胞。分別將pcDNA、pcDNA-MBNL1-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-503-5p轉染至CAL-27細胞中培養24 h，記為pcDNA組、pcDNA-MBNL1-AS1組、anti-miR-503-5p組、anti-miR-503-5p組；將pcDNA-MBNL1-AS1分別與miR-NC、miR-503-5p共轉染至CAL-27細胞中，記為pcDNA-MBNL1-AS1+miR-NC組、pcDNA-MBNL1-AS1+miR-503-5p組。

1.4qRT-PCR檢測lncRNA MBNL1-AS1表達 采用qRT-PCR法提取組織和細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，lncRNA MBNL1-AS1和miR-503-5p以GAPDH和U6為內參，相對表達量采用2ΔΔCt法計算。

1.5MTT法檢測細胞活力 取各組CAL-27細胞(2.5×104/ml)，接種于96孔板(100 μl/L)中培養24、48、72 h后，每孔加MTT溶液20 μl，培養4 h棄上清，每孔加二甲基亞砜150 μl，室溫震蕩孵育5 min，酶標儀檢測450 nm波長處吸光度(OD)值。

1.6Annexin V法檢測細胞凋亡情況 收集各組CAL-27細胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明檢測細胞凋亡情況。PBS液漂洗細胞2次，結合緩沖液重懸后，加入Annexin V-FITC、碘化丙啶各5 μl，37 ℃孵育15 min后，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7Western blot法檢測相關蛋白表達情況 提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒定量。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，暗室中曝光顯影，定影，用Quantity One軟件檢測各組CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax蛋白的相對表達水平。

1.8雙熒光素酶報告基因實驗 構建MBNL1-AS1熒光素酶表達載體WT-MBNL1-AS1和MUT-MBNL1-AS1，CAL-27細胞分別轉染miR-NC(miR-NC組)和miR-503-5p(miR-503-5p組)至WT-MBNL1-AS1、MUT-MBNL1-AS1，按照雙熒光素酶報告基因實驗試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1lncRNA MBNL1-AS1和miR-503-5p在TSCC組織中的表達 TSCC組織中lncRNA MBNL1-AS1和miR-503-5p的表達水平分別低于和高于癌旁組織(P<0.01)。見表1。

表1 lncRNA MBNL1-AS1和miR-503-5p在TSCC組織及癌旁組織中的表達

2.2lncRNA MBNL1-AS1過表達對CAL-27細胞增殖和凋亡的影響 CAL-27細胞轉染pcDNA-MBNL1-AS1后，lncRNA MBNL1-AS1表達升高，表示pcDNA-MBNL1-AS1轉染成功；OD值、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達降低，凋亡率、p21、Bax蛋白表達升高(P<0.01)。見圖1、表2和表3。

表2 lncRNA MBNL1-AS1過表達對TSCC CAL-27細胞增殖和凋亡的影響

表3 lncRNA MBNL1-AS1過表達對TSCC CAL-27細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的影響

圖1 lncRNA MBNL1-AS1過表達對TSCC CAL-27細胞增殖和凋亡的影響

2.3lncRNA MBNL1-AS1靶向調控miR-503-5p的表達 StarBase預測顯示lncRNA MBNL1-AS1與miR-503-5p之間含有互補的核苷酸序列。見圖2。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，與轉染miR-NC的WT-MBNL1-AS1比較，轉染miR-503-5p的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，見表4；分別轉染pcDNA、pcDNA-MBNL1-AS1、si-NC、si-MBNL1-AS1至CAL-27細胞，qRT-PCR檢測miR-503-5p表達水平，miR-503-5p表達水平pcDNA組為1.01±0.08，pcDNA-MBNL1-AS1組為0.45±0.03，si-NC組為1.02±0.07，si-MBNL1-AS1組為2.95±0.28，pcDNA-MBNL1-AS1組miR-503-5p表達水平低于pcDNA組(P<0.05)，si-MBNL1-AS1組miR-503-5p表達水平高于si-NC組(P<0.05)。

表4 TSCC MBNL1-AS1表達的雙熒光素酶報告基因實驗結果

圖2 lncRNA MBNL1-AS1與miR-503-5p互補核苷酸序列

2.4下調miR-503-5p對TSCC CAL-27細胞增殖和凋亡的影響 CAL-27細胞轉染anti-miR-503-5p后，miR-503-5p表達水平降低(P<0.01)，表示anti-miR-503-5p轉染成功；OD值、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平降低，凋亡率、p21、Bax蛋白表達水平升高(P<0.01)。見圖3、表5和表6。

表5 下調miR-503-5p對TSCC CAL-27細胞增殖和凋亡的影響

表6 下調miR-503-5p對TSCC CAL-27細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的影響

圖3 下調miR-503-5p對TSCC CAL-27細胞增殖和凋亡的影響

2.5上調miR-503-5p表達逆轉lncRNA MBNL1-AS1過表達對TSCC CAL-27細胞增殖和凋亡的影響 與CAL-27細胞共轉染pcDNA-MBNL1-AS1、miR-503-5p后，miR-503-5p表達水平升高(P<0.05)；OD值、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平升高，凋亡率、p21、Bax蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖4、圖5、表7和表8。

表7 上調miR-503-5p表達逆轉lncRNA MBNL1-AS1過表達對TSCC CAL-27細胞增殖和凋亡的影響

表8 上調miR-503-5p表達逆轉lncRNA MBNL1-AS1過表達對TSCC CAL-27細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的影響

圖4 上調miR-503-5p表達逆轉lncRNA MBNL1-AS1過表達對舌鱗狀細胞癌CAL-27細胞凋亡的影響

圖5 上調miR-503-5p表達逆轉lncRNA MBNL1-AS1過表達對舌鱗狀細胞癌CAL-27細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的影響

3 討論

研究發現，lncRNAs是染色質修飾、轉錄調控、選擇性剪接及在轉錄或轉錄后水平與RNA和蛋白質復合物相互作用過程中的核心調節因子[8]。lncRNAs參與調節人類癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等惡性生物學行為。在前列腺癌組織和細胞中，lncRNA MBNL1-AS1顯著下調，lncRNA MBNL1-AS1過表達通過靶向下調miR-181a-5p和調節PTEN/PI3K/AKT/mTOR途徑抑制前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，抑制前列腺癌進展[9]。上調miR-338-5p可逆轉lncRNA MBNL1-AS1過表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖和遷移的抑制作用[10]。miR-362-5p由lncRNA MBNL1-AS1調控，并通過靶向QKI促進膀胱癌細胞增殖和生長[11]。lncRNA MBNL1-AS1通過靶向下調miR-135a-5p促進A549和H1975細胞凋亡[12]。lncRNA MBNL1-AS1通過調控miR-412-3p/MYL9軸降低結腸癌腫瘤干細胞的增殖、遷移和侵襲能力[13]。本實驗結果顯示，與癌旁組織比較，TSCC組織中lncRNA MBNL1-AS1表達水平顯著降低，lncRNA MBNL1-AS1過表達顯著降低CAL-27細胞的OD值及CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平，提高細胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達水平，提示lncRNA MBNL1-AS1過表達可抑制CAL-27細胞增殖，促進細胞凋亡，與上述研究結果一致。

有研究表明，lncRNA MBNL1-AS1可作為競爭性內源RNA負調控相關miRNA表達，從而抑制腫瘤進展[13]。本實驗StarBase預測顯示，lncRNA MBNL1-AS1與miR-503-5p含有互補的核苷酸序列，雙熒光素酶報告基因實驗顯示，在WT-MBNL1-AS1中，轉染miR-503-5p的熒光素酶活性顯著降低，且lncRNA MBNL1-AS1靶向負調控miR-503-5p表達。miR-503-5p參與多種癌癥的發生和發展。在結腸癌細胞和組織中，miR-503-5p表達顯著下調，其低表達與結腸癌TNM分期、分化程度和淋巴結轉移顯著相關，過表達可促進結腸癌細胞凋亡和G1期阻滯，抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲[14]。miR-503-5p下調促進了肝細胞癌細胞的遷移和侵襲，miR-503-5p過表達通過下調WEE1抑制肝細胞癌的上皮間充質轉化(EMT)[15]。體外實驗顯示,上調miR-503-5p表達可抑制食管鱗狀細胞癌細胞的生存、侵襲和遷移能力，增強細胞凋亡，體內實驗顯示其表達上調可抑制腫瘤的發生[16]。miR-503-5p可抑制宮頸癌細胞的增殖、轉移和糖酵解過程，miR-503-5p抑制劑可改善敲除circ_0085616對宮頸癌細胞增殖、轉移和糖酵解的抑制作用[17]。miR-503-5p可抑制人絨毛膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲[18]。miR-503-5p通過靶向調控E2F3抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲、遷移和EMT[19]。miR-503-5p過表達通過干擾Rb/E2F信號通路，可抑制膀胱癌細胞的增殖[20]。miR-503-5p過表達通過靶向下調堿性成纖維細胞生長因子，可抑制膀胱癌T24細胞的遷移、侵襲和EMT[21]。在大腸癌奧沙利鉑耐藥細胞中miR-503-5p表達上調，miR-503-5p過表達通過下調PUMA表達可促進大腸癌多藥耐藥[22]。本結果顯示，與癌旁組織比較，癌組織中miR-503-5p表達水平顯著升高，下調miR-503-5p表達可顯著降低CAL-27細胞的OD值、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平，提高細胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達水平，提示下調miR-503-5p表達可抑制CAL-27細胞增殖，促進細胞凋亡；上調miR-503-5p表達逆轉了lncRNA MBNL1-AS1過表達對TSCC CAL-27細胞增殖和凋亡的影響，顯著提高了CAL-27細胞的OD值及CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平，降低細胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達水平，提示lncRNA MBNL1-AS1可能通過調控miR-503-5p表達來影響CAL-27細胞的增殖和凋亡，與上述研究結果相似。

綜上，lncRNA MBNL1-AS1在TSCC組織中表達下調，lncRNA MBNL1-AS1過表達可能通過靶向下調miR-503-5p表達調控TSCC CAL-27細胞的增殖和凋亡，這意味著lncRNA MBNL1-AS1可能成為治療TSCC的新靶點，其在體內的作用及分子作用機制還有待進一步研究。