TLR4基因多態性與宮頸癌易感性的關聯性分析

孫亞楠，楊紅玉，郭 婧，李 楠，蔡玉茹

宮頸癌是全球女性癌性死亡的一個主要原因，病死率僅次于乳腺癌，近年我國宮頸癌發病率呈上升趨勢，嚴重影響了女性健康[1-3]。人類乳頭瘤病毒(HPV)感染被認為是宮頸癌發生發展的影響因素[4]，在已知的200種HPV類型中，HPV 16和18感染關聯的患病率約為70%[5]。雖然HPV感染已成為宮頸癌發病的一個明確原因，但是并非所有感染HPV的婦女都會發展為宮頸癌，而未感染HPV的婦女也會患宮頸癌，這表明個體遺傳因素的變異在影響女性HPV感染和宮頸癌易感性方面發揮了關鍵作用，其中一個因素為先天免疫系統病原體識別受體即Toll樣受體(TLRs)。TLRs在細菌、病毒和其他病原體及抗腫瘤免疫應答方面均有重要作用，其也是感染、組織損傷等多種因素引發炎癥反應的起始因子[6]。同時，炎癥也是重要的致癌因素，炎癥相關TLR基因的遺傳變異在影響致病性感染和癌癥易感性方面具有潛在作用[7]。單核苷酸多態性(SNPs)是廣泛存在于生物基因組中的一種新型分子標志物，可能影響基因的調控、表達和功能[8-10]，基于炎癥在宮頸癌中的重要作用及TLR基因SNPs與宮頸癌易感性的關聯性，本研究旨在檢測TLR4基因SNPs，探討其與宮頸癌易感性的關系，以期為宮頸癌的防治提供參考依據。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取解放軍聯勤保障部隊第九八〇醫院婦產科和河北醫科大學第二醫院婦科2012—2020年來院的503例宮頸癌(宮頸癌組)和495例體檢健康者(對照組)。宮頸癌患者入組條件：經病理檢查確診，排除患有其他癌癥、接受過放化療者，患者彼此間無親屬關系。對照組納入標準：無腫瘤家族史和宮頸相關疾病者。納入對象基本特征信息包括年齡、初婚年齡和生育史。宮頸癌組臨床信息包括腫瘤類型和腫瘤分期，腫瘤分期依據國際婦產科學聯合會(FIGO)標準。本研究通過醫院醫學倫理委員會批準并經患者知情同意。

1.2位點篩選和基因分型 選取TLR4基因的4個SNPs位點：rs4986790、rs10759931、rs11536889和rs1927911。全血DNA提取：收集所有樣本的外周血2 ml，采用全血DNA提取試劑盒提取基因組DNA(北京艾德萊)，DNA樣本采用微量分光光度計定量，并于-70 ℃環境下保存備用。采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性技術行基因分型，酶切產物采用3%瓊脂糖凝膠電泳進行分型。PCR試劑盒購自Takara公司，限制性內切酶為快反應內切酶購自Thermo公司。位點基本信息、引物設計和限制性內切酶見表1。

表1 TLR4基因SNPs基本信息和PCR-RFLP實驗條件

2 結果

2.1臨床資料比較 宮頸癌組年齡為(44.43±7.60)歲，對照組年齡為(44.05±7.08)歲；宮頸癌組初婚年齡為(24.52±3.02)歲，對照組初婚年齡為(26.16±3.166)歲；宮頸癌組初產年齡為(26.23±2.80)歲，對照組初產年齡為(27.98±3.17)歲；宮頸癌組產次≤2次者485例，>2次者18例；對照組產次≤2次者483例，>2次者12例。2組在初婚年齡、初產年齡方面比較差異有統計學意義(P<0.01)，在年齡、產次方面比較差異無統計學意義(P>0.05)。因此，在后續Logistic回歸分析時應對初婚年齡和初產年齡予以校正。此外，宮頸癌組病理分型為鱗癌479例(95.2%)，腺癌19例(3.8%)，其他5例(1.0%)；FIGO分期Ⅰ期218例(43.3%)、Ⅱ期196例(39.0%)、Ⅲ期56例(11.1%)、Ⅳ期33例(6.6%)。

2.2平衡性校驗結果 所有SNPs位點在2組群體中符合Hardy-weinberg平衡(P>0.05)，表明研究群體具有良好的代表性；連鎖不平衡檢驗結果顯示：4個SNPs位點間不存在連鎖遺傳，D'趨近于1，因此可以進行單倍型分析。見表2。

表2 TLR4基因多態性與宮頸癌易感性的平衡性校驗分析

2.3基因多態性分析 TLR4基因rs4986790、rs10759931和rs11536889等位基因和基因型分布2組間比較差異有統計學意義(P<0.01)，而rs1927911的基因型分布2組間比較無差異(P>0.05)。校正初婚年齡和初產年齡后，rs4986790的AG基因型、rs10759931的GG基因型和rs11536889的CC基因型與宮頸癌的發病風險增加有關(P<0.05，P<0.01)。此外，通過對宮頸癌早期(Ⅰ+Ⅱ期)和晚期(Ⅲ+Ⅳ期)與基因型分布的關系發現，TLR4的4個SNPs位點基因多態性與宮頸癌FIGO分期無明顯關聯，TLR4的4個SNPs位點等位基因和基因型分布與宮頸癌發病風險相關聯。見表3。

表3 TLR4的4個SNPs位點的等位基因和基因型分布與宮頸癌發病風險的關聯性分析

2.4單倍型多態性分析 在單倍型分布率與宮頸癌發病風險的關聯性分析中，以單倍型A-A-G-C為參考，單倍型G-A-G-T、G-A-C-C和A-A-C-T與宮頸癌發病風險增加相關，而單倍型A-A-C-C則與宮頸癌發病風險降低有關(P<0.05，P<0.01)；宮頸癌組和對照組單倍型G-A-G-T分布率分別為0.166和0.133，攜帶該單倍型個體的宮頸癌易感性風險值為1.627(95%CI：1.224，2.163，P=0.001)。見表4。

表4 宮頸癌單倍型分布與發病風險的關聯性分析

3 討論

TLR4基因位于9號染色體q32-q33，包含4個外顯子，在淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、多形核白細胞和脾細胞中高度表達[11]。TLR4在免疫系統中發揮關鍵作用，參與介導機體對病毒、細菌、真菌等外來病原體引起的炎癥反應[12]，并參與多種腫瘤的發生發展，尤其是以感染作為危險因素的腫瘤[13-15]。宮頸癌易感性受遺傳和環境因素的影響，HPV感染是宮頸癌發病的主要環境因素，研究表明，TLR4的表達與HPV陽性宮頸癌的發生和發展密切相關，而發生在TLR4啟動子區的變異會影響TLR4的表達水平[16]。隨著全基因組關聯分析的不斷深入，已有多項研究報道TLR 2、4和9基因多態性在宮頸癌易感性中的重要作用[17-20]，但這些研究得出的結果并不一致。

基于TLR4基因在炎癥和腫瘤中的易感性，本研究選取了TLR4基因的4個功能型SNPs位點，分別位于5'-UTR(rs10759931)、3'-UTR(rs11536889)、外顯子(rs4986790)和內含子(rs1927911)，涵蓋了該基因的不同區域。本研究結果顯示：rs4986790、rs10759931和rs11536889位點與宮頸癌的發病存在明顯關聯，攜帶基因型AG(rs4986790)、GG(rs10759931)和CC(rs11536889)的個體具有潛在的宮頸癌易感性，發病風險分別增加了1.687、1.888和3.776倍。ZIDI等[19]報道TLR4 rs4986790位點的G等位基因和AG基因型與宮頸癌風險增加有關，印度北部地區群體的rs11536889雜合基因型GC與宮頸癌風險增加有關[20-22]，而且位于TLR4基因3'-UTR區的SNPs(rs11536889)的G等位基因被證實在TLR4表達中發揮關鍵作用[23]。與本研究所得出結果不同的是，印度宮頸癌群體TLR4基因內含子rs1927911位點的雜合基因型與宮頸癌風險顯著相關[22]，而在波蘭女性群體中，rs10759931變異則對宮頸癌發病起保護作用[18]。可見，不同群體的疾病易感基因譜不盡相同。

由于單倍型分析較單一的SNPs分析更能體現出遺傳易感性在腫瘤發病中的表現度[24]，本研究對TLR4基因的4個SNPs位點進行分析，結果顯示4個SNPs位點不存在連鎖遺傳，共構成單倍型10種，其中7種單倍型分布率超過4%，通過對單倍型分布率分布和宮頸癌發病情況進行分析，發現單倍型A-A-G-C和G-A-G-T分布率與宮頸癌發病風險存在明顯關聯，以單倍型A-A-G-C作為對照，3種單倍型與宮頸癌發病風險增加相關，1種單倍型與宮頸癌發病風險降低有關，但由于單倍型G-A-C-C、A-A-C-T和A-A-C-C分布率2組間均較低，不能準確反映其與宮頸癌發病的關聯性，而單倍型G-A-G-T分布率在研究群體中相對較高，其風險值評估可以作為參考，攜帶單倍型G-A-G-T的個體患宮頸癌的風險提高了1.627倍。

本研究仍存在較多不足之處，首先，由于HPV感染是宮頸癌發病的重要因素，較多研究將HPV感染作為混雜因素對基因多態性分析進行校正[21-22,25]，本研究由于樣本收集較早，早期并未對HPV感染的臨床數據收集完善，若剔除早期樣本量又不能很好反映基因多態性與宮頸癌發病的關聯。近些年，隨著宮頸癌患者和健康體檢者HPV感染檢測的常規化，后續將對HPV感染類型和靶基因多態性的關系進行深入探討；其次，本研究基于病例對照研究，缺少相應機制和功能學的同步佐證，后續我們將研究TLR家族參與炎癥所致腫瘤的機制；再次，本研究樣本只收集本地區的2家醫院，存在選擇偏倚情況，擴大收集范圍和增加樣本量仍是今后研究應改進之處。

綜上，TLR4基因rs4986790、rs10759931和rs11536889位點的多態性與宮頸癌發病風險存在明顯關聯，TLR4可以作為宮頸癌的易感基因，為宮頸癌的早期篩查和個性化診治提供參考依據。