辣椒素對AngⅡ誘導VSMC增殖遷移及DOCA-鹽引起的高血壓大鼠血管重構的影響

周 毅，王雪笠，黎炳護，朱艷霞，甄 寧，高利濤，劉 軍，王 麗，智建霞，張莉莉

在高血壓慢性病程中，各級動脈出現結構或功能改變，包括細胞增殖、遷移、調亡及基質成分的改變和重排等各種復雜動態過程，最終引起血管重構。高血壓血管重構的早期事件和重要環節是血管平滑肌細胞(VSMC)的表型轉化。高血壓狀態下腦動脈中膜VSMC發生表型轉化，由正常的收縮表型(分化表型)轉化為合成表型(去分化表型)，自身發生VSMC增殖和遷移引起中膜增厚，是造成管腔狹窄的主要原因[1]。腦動脈這種組成結構的改變使得毛細血管床灌注及腦血流量減少，最終引起腦卒中。辣椒中的活性成分辣椒素(Cap)已被證明對肥胖、糖尿病和心血管疾病有積極的治療作用[2-3]。美國國家健康和營養調查Ⅲ的一項大規模、以人群為基礎的前瞻性研究表明，經常食用辣椒與較低的病死率有關[4]。同樣，意大利的一項基于人群的研究報告稱，每天食用辣椒可以顯著降低心腦血管相關死亡的發生率[5]。此外，Cap被證明可以減輕神經退行性疾病模型動物的行為缺陷，如減少異常的不自主運動，改善空間學習和記憶能力[6-7]。Cap能夠通過AMPK/NF-κB信號通路，降低基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達來抑制食管鱗狀細胞癌的遷移和侵襲。Cap貼劑能夠治療化療誘導的周圍神經病理性疼痛，不僅緩解了疼痛，還避免了中樞神經系統不良反應[8]。一項涉及10個對照研究及398名參與者的薈萃分析表明，膳食中補充Cap可降低血清總膽固醇水平[9]。本研究旨在探討Cap是否能夠抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導VSMC的增殖遷移，減輕醋酸去氧皮質酮(DOCA)-鹽引起的大鼠血壓升高，進而抑制高血壓引起的頸動脈內膜增生。

1 材料與方法

1.1實驗動物及材料 雄性WKY大鼠(SPF級，10周齡)，體質量200～250 g，購自陸軍軍醫大學特色醫學中心實驗動物中心，實驗動物許可證號[SYXK(軍)2017-0058]。胎牛血清、DMEM培養基購自美國Gibco公司。胰酶細胞消化液購自江蘇碧云天生物技術研究所。Cap、辣椒素抑制劑(CapZ)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)一抗購自英國Abcam公司。AngⅡ、DOCA購自美國Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物造模及分組：WKY大鼠使用10%水合氯醛麻醉，俯臥位固定在手術臺上，左側背部剪毛，備皮，使用碘伏嚴格消毒。沿脊柱外側、肋骨下緣做一長2.0～2.5 cm切口，從腹后膜進入找到腎臟，暴露整個左側腎臟，并游離腎蒂，切除左側腎臟。消毒后縫合肌層和皮膚。腎臟切除后觀察1周，然后將40只實驗大鼠隨機分為4組：對照組(Con組)，肩胛部皮下注射普通植物油，普通飼料喂養，正常飲水；模型組(DOCA組)，肩胛部皮下注射40 mg/kg DOCA油劑，飲水中加入1%氯化鈉溶液和0.1%氯化鉀溶液；DOCA+Cap組，在DOCA組基礎上飼料中添加0.01% Cap；DOCA+Cap+CapZ組，在DOCA+Cap組基礎上飼料中添加0.01% CapZ。

1.2.2細胞培養及分組：采用組織塊貼壁法培養VSMC。取小鼠胸主動脈，用含青、鏈霉素的無菌PBS液浸洗，仔細剝除纖維層和外膜。縱行剖開血管使內膜面向上，用眼科彎剪輕刮2～3遍去除血管內皮細胞。更換培養皿，將血管中層組織剪切成1 mm3小塊，接種于25 ml培養瓶中，組織塊間隙約為0.5 cm，瓶內加入含20%胎牛血清的DMEM/高糖培養基，直立于37 ℃、5% CO2無菌恒溫培養箱中培養2～4 h，待組織塊緊貼瓶底后輕輕翻轉培養瓶，使培養基浸沒組織塊，3 d后更換培養基。待組織塊有細胞爬出，且足夠傳代后行第一次傳代，后待細胞生長至瓶底面積80%～90%即可傳代培養。傳代至第三代時，應用α-SMA鑒定原代VSMC。

1.2.3MTT法觀察VSMC增殖情況：將3×104/ml的細胞懸液種植在96孔板上。應用AngⅡ(100 nmol/L)、Cap(1 μmol/L)、CapZ(1 μmol/L)將細胞分為空白對照組、AngⅡ組、AngⅡ+Cap組、AngⅡ+Cap+CapZ組。然后細胞樣品與20 μl MTT在37 ℃下孵育4 h, 200 μl DMSO充分混合細胞。用酶標儀(Bio-Rad, CA, USA)測定570 nm波長處吸光度。

1.2.4劃痕實驗觀察VSMC遷移情況：取對數生長期細胞，接種于24孔培養板中，每組細胞設3個復孔。當細胞鋪滿培養板后，用移液器槍頭沿培養板底部劃“一”字形劃痕單層培養細胞，以此計時，鏡下記錄初始劃痕區的相對距離。吸除原有培養液，無血清培養液輕洗2次，洗掉去除的細胞，加入含有10%胎牛血清的培養液及各組對應的干預試劑繼續培養24 h，倒置顯微鏡下記錄劃痕的寬度并照相。

1.2.5Western blot法檢測相關蛋白水平：采用Western blot法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)和MMP-9蛋白水平。蛋白質樣本取自原代培養VSMC。蛋白質樣品經12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上用抗PCNA(1︰500)、抗MMP-9(1︰500)和抗β-肌動蛋白(1︰2000)一抗在4 ℃下孵育過夜。洗滌后，將PVDF膜與辣根過氧化物酶耦聯的二抗在室溫下孵育2 h，然后應用Gel Doc 2000成像儀(美國CA Bio-Rad)采用密度法定量蛋白水平，以β-actin為正常對照。

1.2.6血壓測定：在大鼠清醒狀態下，使用智能無創鼠尾血壓測定儀測量各組大鼠鼠尾收縮壓(SBP)，每周測量1次。測量時首先將大鼠固定在合適的固定籠中，放置在37 ℃恒溫加熱架上預熱5～10 min，使鼠尾血管充分擴張以便感應器感應。然后將鼠尾套在血壓測量感應器壓套上，壓力傳感器達鼠尾近心端約1/4處時固定傳感器和大鼠。待大鼠充分安靜后，打開血壓檢測系統，獲取血壓波形，并用軟件記錄。每次測量間隔2 min，每只大鼠重復測量5次，取平均值。

1.2.7HE染色觀察頸動脈內膜增生情況：應用10%水合氯醛麻醉實驗大鼠后以4%多聚甲醛溶液灌注固定，灌注結束后取大鼠頸動脈，置于4%多聚甲醛溶液中在4 ℃冰箱中固定24 h。灌注固定血管石蠟包埋，切片厚度6 μm，采用HE染色分析測量外彈性層(EEL)內面積、內彈力層(IEL)內面積和管腔面積。內膜面積=IEL內面積-管腔面積，EEL和IEL之間為中膜面積，通過計算內膜與中膜面積的比值來評估內膜增生程度。應用Tissue Gnostics顯微鏡記錄圖片。

2 結果

2.1AngⅡ誘導VSMC增殖遷移情況 應用組織貼片法原代培養大鼠胸主動脈來源的VSMC，用免疫熒光法檢測培養細胞中α-SMA的表達(圖1)，表明培養細胞可用于進一步實驗。應用劃痕實驗檢測VSMC遷移情況，24 h后AngⅡ組細胞劃痕寬度明顯減小，細胞向劃痕處遷移，空白對照組細胞無此現象；AngⅡ組細胞遷移情況優于空白對照組(P<0.05)。見圖2。應用MTT法檢測VSMC增殖情況，結果顯示AngⅡ組細胞增殖情況優于空白對照組(P<0.05)，見圖3。

圖1 免疫熒光法檢測原代培養的血管平滑肌細胞中α-平滑肌肌動蛋白表達(×400)

圖2 劃痕實驗觀察AngⅡ對VSMC遷移的作用(×100)

圖3 MTT法檢測AngⅡ對VSMC增殖的影響

2.2Cap抑制AngⅡ誘導的VSMC表型轉化情況 為觀察Cap對AngⅡ誘導的VSMC增殖、遷移的影響，我們給予Cap(1 μmol/L)及CapZ(1 μmol/L)后觀察細胞增殖遷移情況。應用MTT和Western blot法檢測細胞PCNA表達，觀察細胞增殖情況；應用劃痕試驗及Western blot法檢測細胞MMP-9表達，觀察細胞遷移情況。結果顯示，AngⅡ組大于空白對照組，AngⅡ+Cap組小于AngⅡ組，AngⅡ+Cap+CapZ組大于AngⅡ+Cap組(P<0.05)；PCNA和MMP-9水平，AngⅡ組大于空白對照組，AngⅡ+Cap組小于AngⅡ組，AngⅡ+Cap+CapZ組大于AngⅡ+Cap組(P<0.05)。見圖4～6。

圖4 劃痕實驗檢測各組大鼠VSMC遷移情況

2.3Cap對DOCA-鹽飲食大鼠血壓的影響 單純Cap膳食干預對大鼠血壓無明顯影響，DOCA組SBP較Con組顯著升高(P<0.05)，提示Cap膳食本身對SBP無明顯影響。DOCA+Cap組SBP較DOCA組升高程度明顯減小(P<0.05)；DOCA+Cap+CapZ組SBP較DOCA+Cap組又明顯升高(P<0.05)。見表1、圖7。

圖7 Cap膳食對DOCA-鹽飲食大鼠血壓的影響

表1 Cap膳食對DOCA-鹽飲食大鼠收縮壓的影響

2.4Cap對DOCA-鹽引起的高血壓大鼠血管重構的影響 頸動脈內膜增生程度，DOCA組明顯大于Con組，DOCA+Cap組明顯小于DOCA組，DOCA+Cap+CapZ組明顯大于DOCA+Cap組(P<0.05)，見圖8。

圖8 HE染色觀察Cap膳食對高血壓大鼠頸動脈內膜的影響(×200)

3 討論

已經證實，高血壓是腦卒中的獨立危險因素[10]。在高血壓慢性病程中，各級動脈出現結構或功能上的系列改變，最終引起血管重構。高血壓動脈重構的早期事件和重要環節是VSMC的表型轉化。成年個體血管中VSMC主要為分化表型，多種收縮蛋白高表達，而維持非常低的增殖與合成能力，主要發揮收縮功能以調節血管張力和維持血壓。

圖5 MTT法檢測各組大鼠VSMC增殖情況

圖6 Western blot法檢測各組大鼠VSMC PCNA和MMP-9的表達

與骨骼肌或心肌細胞不同的是，VSMC可以在各種刺激下發生去分化而出現未分化細胞的表型特征，如增殖遷移活躍、基質蛋白合成增多、離子通道和微結構改變等，被稱為表型轉化。適度的VSMC表型轉化是血管對環境刺激的適應性反應。例如在輕度機械損傷或血管生成時，VSMC發生表型轉化，通過增殖、遷移并合成細胞外基質促進血管修復或血管形態的形成。但是在血壓升高的情況下，VSMC的表型轉化導致VSMC大量增殖和遷移，并在內膜下聚集，分泌大量細胞外基質和多種炎性因子，最終引起血管重構和血管疾病的發生[9]。發生了表型轉化的VSMC是血管重構的主要成分，在動脈粥樣硬化病變中，增殖的VSMC及其分泌的細胞外基質占病變體積的70%以上[11]。原代培養的大鼠胸主動脈VSMC在AngⅡ刺激下發生表型轉化，細胞增殖遷移能力顯著增強。我們應用DOCA-鹽模型在體研究高血壓對血管內膜增生的作用，結果顯示，高血壓狀態下，DOCA組大鼠頸動脈內膜較Con組大鼠增生明顯，動脈內膜顯著增厚。

Cap是辣椒中的辛辣成分，在世界范圍內作為蔬菜和香料食用[12]。研究發現，Cap膳食可以改善內皮細胞功能[13]，減輕動脈粥樣硬化[14-15]，延緩腦卒中的發生。此外，Cap膳食還能夠改善腦卒中后腦血管側支循環[16-18]。還有研究證實，Cap可以維持血糖穩態，改善高血糖誘導的內皮功能障礙，并預防糖尿病心血管并發癥[19-20]。本研究表明，Cap能夠抑制AngⅡ誘導的原代培養的VSMC增殖遷移。在體研究結果顯示，Cap膳食能夠顯著降低DOCA-鹽飲食大鼠血壓的升高，且能夠明顯減輕高血壓引起的頸動脈內膜增生。

總之，Cap能夠抑制VSMC表型轉化，降低DOCA-鹽引起的大鼠血壓升高，減輕因高血壓導致的大鼠頸動脈內膜增生，為高血壓引起的血管重構治療提供了新方法。