miR-181a通過調(diào)節(jié)Bcl-2逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的耐藥作用

盧慧敏，韓高華，錢靜宇

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬泰州人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300）

白血病是一類高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，按分化程度可分為急性和慢性。急性粒細(xì)胞白血病（Acute myeloid leukemia,AML） 是由轉(zhuǎn)化的造血干細(xì)胞（Acute myeloid leukemia, HSC）通過獲得性遺傳異常（包括染色體重排和多基因突變）而產(chǎn)生的克隆性擴(kuò)增及造血分化受損導(dǎo)致的。因其惡化快速，若沒有進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委熆赡茉诙虝r間內(nèi)致命。獲得性突變增強(qiáng)HSC 的自我更新和增殖，其中正常的分化機(jī)制受損，最終導(dǎo)致異常未成熟白血病原始細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，使得這些原始細(xì)胞在骨髓中積累，逐漸取代正常的造血組織，干擾正常血細(xì)胞的產(chǎn)生，導(dǎo)致造血功能受損和骨髓衰竭，出現(xiàn)血細(xì)胞減少的現(xiàn)象[1]。

AML常在老年人中高發(fā)。據(jù)報道，AML 的發(fā)病率為每100，000 人3～5 例，中位診斷年齡約為68 歲。雖然AML 在男性中的發(fā)病率略高于女性（比例為5∶3），但在種族和民族上相似。目前，只有大約35%～40%的小于60歲的患者和5%～15%的大于60 歲的患者可治愈該疾病。10%～40%的患者在強(qiáng)化誘導(dǎo)治療后仍未達(dá)到CR，并被認(rèn)為患有原發(fā)性難治性疾病。盡管部分患者能夠達(dá)到CR，超過50%的患者隨后疾病復(fù)發(fā)。對于復(fù)發(fā)的患者，其中只有一小部分患者能成功獲得第二次CR。此外，鑒于并存疾病和缺乏合適的供體，這些患者通常不適合進(jìn)行異體造血干細(xì)胞移植（alloHSCT）治療。因此，這為復(fù)發(fā)性和難治性AML的治療留下了巨大的臨床需求[2]。

miR-181a 是研究較多的一種與造血調(diào)控相關(guān)的MicroRNA （miRNA），與B 細(xì)胞分化相關(guān)。miR-181a與多種腫瘤細(xì)胞如膠質(zhì)瘤、胰腺癌等增殖侵襲相關(guān)[3,4]。近年，miR-181a 與白血病的關(guān)系也廣受關(guān)注，Li 等[5]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a 可促進(jìn)柔紅霉素耐藥的K562/A02細(xì)胞凋亡。miR-181a與白血病細(xì)胞耐藥之間的關(guān)系及其分子機(jī)制，目前鮮有報道，本研究從臨床標(biāo)本出發(fā)，通過進(jìn)一步分析HL60及其阿霉素耐藥株HL60/ADR細(xì)胞中miR-181a 和Bcl-2 的表達(dá)差異，探討miR-181a 與白血病細(xì)胞耐藥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2019 年1 月至2021 年3 月經(jīng)泰州市人民醫(yī)院血液內(nèi)科確診的AML 患者45 例，其中初診22 例，完全緩解者12 例，復(fù)發(fā)11 例。男性25 例，女性20 例；年齡63～80 歲，中位年齡67.45歲。正常對照10例，其中男性5例，女性5例；年齡52～78歲，中位年齡64.57歲。

1.2 骨髓標(biāo)本有核細(xì)胞分離 取EDTA-K2 抗凝的骨髓標(biāo)本1.5ml 加入紅細(xì)胞裂解液5～8ml，充分混勻，放置約10min，直至紅細(xì)胞完全破壞。1500r/min離心5min，丟棄上清，滴加約10ml生理鹽水重懸，1500r/min 離心5min，共洗滌3 次。棄上清后加入1ml Trizol 液，再轉(zhuǎn)移到EP 管里，保存于-80℃冰箱以備用。

1.3 寡核酸探針 所有寡核酸探針均購自廣州銳博生物有限公司，miR-181a 模擬物序列是5’-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3’；miR-181a抑制物序列是5’-UCACCGACAGCGUUGAAUGUUU U-3’；對照序列是UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HL60及HL60/ADR細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，均用含10%胎牛血清（Gibco，USA）的RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco，USA），并將細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。加入1.0mg/L 阿霉素（深圳市思美泉生物科技有限公司）以維持HL60/ADR細(xì)胞株的耐藥性，停藥2周后進(jìn)行后續(xù)實驗。HL60及HL60/ADR 細(xì)胞培養(yǎng)于六孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80～90%時細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程均按脂質(zhì)體2000（Invitrogen,USA）試劑說明書進(jìn)行實驗。脂質(zhì)體2000 的終濃度為1μg/mL，寡核苷酸及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染終濃度分別為200 nmol/L 及1μg/mL。將寡核苷酸及質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000 置于無血清RPMI 1640 培養(yǎng)基中混勻，用于后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗，48h后收集細(xì)胞以進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)實驗。

1.5 MTT 法檢測細(xì)胞存活率 以48 孔板上每孔4×104個細(xì)胞的密度接種于細(xì)胞板內(nèi)，細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)染寡核酸探針。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，將配好的不同濃度的阿霉素加入細(xì)胞中，最后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。處理48h 后，向每孔中加入25 μl 配好的MTT 溶液，再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4h 后將48孔板中的培養(yǎng)液倒掉，每孔加入300 μl DMSO溶解藍(lán)色結(jié)晶，然后將48孔板放入酶標(biāo)儀中37℃孵育10 min，在570 nm下測定每孔的吸光度。

1.6 實時熒光定量PCR檢測miR-181a和BCL-2的表達(dá) 利用Trizol（Invitrogen, USA）提取骨髓有核細(xì)胞、HL60細(xì)胞或HL60/ADR細(xì)胞的總RNA。采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Life Technologies, USA）將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成特定microRNA的cDNA：miR-181a和內(nèi)參U6的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物分別為：5’-GTCGTATCCAGTGCAGG GTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACACTCAC-3’；5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA-GGTAT TCGCACTGGATACGACACGATT-3’。使用TaqMan MicroRNA Assay Kit（Applied Biosystems,USA）檢測miR-181a 的表達(dá)水平。其中miR-181a 和U6 定量PCR 上游引物分別為： 5’-GAACATTCAACGC TGTCG-3’；5’-CCTGCGCAAGG ATGAC-3’。下游引物均為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。采用ReverTra Ace qPCR RT Kit （TOYOBO, Japan）將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO, Japan）檢測Bcl-2 的mRNA 水平。其中Bcl-2 定量引物序列為5’-ATGGCGCACGCTGGGAGAACAGGGT-3’（上游引物）和5’-ACAGCCAGGAGAAATCAAA CAGAGGC-3’（下游引物）。使用β-Actin 作為內(nèi)參，其序列為5’-CAGAGCCTCGCCTTTGCC-3’（上游引物）和5’-GTCGCCCACATAGGAATC-3’（下游引物）。PCR擴(kuò)增程序如下：94℃變性5 min,隨后94℃作用30 s，60℃作用30 s，72℃作用40 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。

1.7 Western Blot實驗 將HL60或HL60/ADR細(xì)胞置于RIPA 裂解液中（50 mM Tris–HCl,pH 7.4;1% NP-40; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA；1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride）。使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-Polyacrylamidegelelectrophoresis, SDS-PAGE）將蛋白進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜（Millipore,USA）上。將PVDF膜置于5%脫脂奶粉里封閉2h 后，將其置于4℃用Bcl-2（Abcam,UK）或β-actin 抗體（Santa Cruz Biotechnology,Canada）孵育過夜，抗體使用稀釋度均為1∶1000。第二天將辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗滴加于PVDF膜上，在室溫中孵育1小時。ECL顯色后曝光。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行分析，應(yīng)用配對T 檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-181a 和Bcl-2 在臨床標(biāo)本中的表達(dá)水平 通過實時熒光定量PCR 方法，分別檢測了miR-181a 和Bcl-2 在正常者、AML 初診者、復(fù)發(fā)者和緩解者樣本中的表達(dá)，以正常者的表達(dá)水平設(shè)為1。結(jié)果如圖1 所示，與正常者的樣本比較，緩解者樣本中miR-181a 和Bcl-2 表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而與緩解者的樣本比較，初診者和復(fù)發(fā)者樣本中miR-181a 表達(dá)量均下降，Bcl-2的表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這一結(jié)果說明miR-181a 低表達(dá)以及Bcl-2的高表達(dá)可能與臨床復(fù)發(fā)相關(guān)。

圖1 miR-181a和Bcl-2在臨床樣品中的表達(dá)水平

2.2 HL60 及HL60/ADR 細(xì) 胞 中miR-181a 和Bcl-2 的表達(dá)水平 實時熒光定量PCR 分別檢測HL60 和HL60/ADR 細(xì) 胞 中miR-181a 和Bcl-2 的mRNA 表達(dá)水平變化。結(jié)果如圖2 所示，與HL60細(xì)胞比較，HL60/ADR 細(xì)胞中miR-181a 的mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而HL60/ADR 細(xì)胞中Bcl-2 的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Western Blot 檢測結(jié)果如圖3 所示，與HL60 細(xì)胞比較，HL60/ADR細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明miR-181a低表達(dá)及Bcl-2的高表達(dá)與細(xì)胞耐藥緊密相關(guān)。

圖2 miR-181a和Bcl-2在HL60及HL60/ADR細(xì)胞中的表達(dá)水平

圖3 Bcl-2在HL60/ADR和HL60細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平

2.3 miR-181a 能逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的耐藥性 將miR-181a 模擬物轉(zhuǎn)染入HL60/ADR 細(xì)胞中。24h之后，將配好不同濃度的阿霉素（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4mg/ml）加入細(xì)胞中。刺激48h，通過MTT 法檢測處理后細(xì)胞的存活率，并計算細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50。結(jié)果如圖4A所示，未轉(zhuǎn)染的HL60/ADR細(xì)胞IC50值為4.67 mg/ml。與轉(zhuǎn)染對照寡核苷酸探針的HL60/ADR 細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物的細(xì)胞的存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染對照探針的細(xì)胞IC50 為3.69 mg/ml，而轉(zhuǎn)染miR-181a 模擬物的細(xì)胞IC50 為1.44 mg/ml，說明細(xì)胞對藥物變得敏感。同樣地，將miR-181a 抑制物轉(zhuǎn)染入HL60 細(xì)胞，24h 之后，將配好不同濃度的阿霉素（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4mg/ml）加入細(xì)胞中。刺激48h，通過MTT 法檢測處理后細(xì)胞的存活率，并計算細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50。結(jié)果如圖4B 所示，未轉(zhuǎn)染的HL60 細(xì)胞IC50 值為0.08 mg/ml。與轉(zhuǎn)染對照寡核苷酸探針的HL60 細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miR-181a 抑制物的細(xì)胞的存活率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染對照探針的細(xì)胞IC50為0.07 mg/ml，而轉(zhuǎn)染miR-181a 抑制物的細(xì)胞IC50為0.51 mg/ml，表明細(xì)胞對藥物敏感性降低。綜上所述說明miR-181a 能改變白血病細(xì)胞的耐藥性。當(dāng)miR-181a表達(dá)增強(qiáng)時，藥物對白血病細(xì)胞起一定的作用；當(dāng)miR-181a表達(dá)減少時，藥物對白血病細(xì)胞沒有作用。

圖4 miR-181a對HL60/ADR和HL60細(xì)胞增殖抑制的影響

2.4 miR-181a 能調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞中Bcl-2 的表達(dá) 與轉(zhuǎn)染對照寡核苷酸探針的HL60/ADR 細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miR-181a 模擬物的細(xì)胞中Bcl-2 的表達(dá)水平明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖5A）；與轉(zhuǎn)染對照寡核苷酸探針的HL60 細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miR-181a 抑制物的細(xì)胞中Bcl-2 的表達(dá)水平明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖5B）。Western Blot 檢測結(jié)果與定量PCR 一致，與轉(zhuǎn)染對照寡核苷酸探針的HL60/ADR 細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物的細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖5C）；與轉(zhuǎn)染對照寡核苷酸探針的HL60細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miR-181a抑制物的細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖5D）。

圖5 miR-181a對Bcl-2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

3 討論

microRNA（miRNAs）是一類廣泛表達(dá)于后生動物和真核生物中的非編碼的小（長度約22個核苷酸）RNA。miRNA 似乎是腫瘤發(fā)生和產(chǎn)生耐藥性的重要調(diào)節(jié)因子。目前，少有研究探討miRNA在造血中的重要性，仍需更多的研究。miR-181a是近年來廣泛研究的一類與造血調(diào)控相關(guān)的miRNA，不僅可以促進(jìn)B 細(xì)胞分化，而且有研究表明miR-181a 在T 細(xì)胞成熟中具有重要作用，其在CD4+CD8+T 細(xì)胞發(fā)育階段特異性富集，并能夠抑制陽性選擇和T 細(xì)胞成熟相關(guān)的基因表達(dá)，如Bcl-2、CD69和TCR[6]。

近年來，越來越多的研究關(guān)注miR-181a與白血病之間的關(guān)系。miR-181a作為正常造血的調(diào)節(jié)因子，其破壞與各種類型的癌癥有關(guān)，包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤。它是淋巴細(xì)胞中含量最豐富的miRs之一。在AML中，miR-181a具有致癌基因以及腫瘤抑制基因的雙重作用，這取決于細(xì)胞環(huán)境及其靶標(biāo)的后續(xù)表達(dá)[7]。Xu 等[8]研究表明人白血病細(xì)胞HL60中過表達(dá)miR-181a能抑制細(xì)胞的增殖。

本研究通過臨床標(biāo)本的檢測發(fā)現(xiàn)，AML 復(fù)發(fā)患者骨髓核細(xì)胞中除了miR-181a低表達(dá)，另一個與白血病發(fā)生相關(guān)的重要分子Bcl-2高表達(dá)，這一結(jié)果說明miR-181a和Bcl-2可能都與AML復(fù)發(fā)相關(guān)。進(jìn)一步通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、實時熒光定量PCR、Western Blot 及MTT 法檢測結(jié)果證實了與HL60/ADR 細(xì)胞比較，HL60 細(xì)胞中miR-181a 的表達(dá)水平明顯升高。通過miR-181a模擬物和抑制物的轉(zhuǎn)染結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-181a 的HL60/ADR 細(xì)胞存活率明顯減少，其IC50 由3.69 mg/ml降低為1.44 mg/ml，說明HL60/ADR 細(xì)胞的耐藥性下降。反之，低表達(dá)miR-181a的HL60細(xì)胞存活率明顯提高，其IC50由0.07 mg/ml增加為0.51 mg/ml，說明HL60 細(xì)胞的耐藥性增強(qiáng)。這些結(jié)果表明miR-181a不僅參與了白血病細(xì)胞的增殖抑制，而且參與了白血病細(xì)胞的耐藥。阿霉素對HL60/ADR 細(xì)胞抑制的IC50 值為4.67 mg/ml，而對HL60細(xì)胞抑制的IC50值為0.08 mg/ml，HL60/ADR耐藥倍數(shù)約為58 倍，與文獻(xiàn)報道一致[9]。與HL60 比較，HL60/ADR 中Bcl-2表達(dá)水平明顯升高；與轉(zhuǎn)染對照寡核苷酸探針的HL60/ADR 細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miR-181a 模擬物的細(xì)胞中Bcl-2 的表達(dá)水平明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與轉(zhuǎn)染對照寡核苷酸探針的HL60 細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miR-181a 抑制物的細(xì)胞中Bcl-2 的表達(dá)水平明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），這些結(jié)果說明miR-181a對Bcl-2的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-181a參與白血病耐藥形成，并發(fā)現(xiàn)miR-181a 可負(fù)調(diào)控Bcl-2 的表達(dá)。下調(diào)Bcl-2 可引發(fā)細(xì)胞凋亡，這表明miR-181a 可能通過靶向Bcl-2 發(fā)揮其作用。在該項研究中，發(fā)現(xiàn)miR-181a 低表達(dá)是Bcl-2 在HL60/ADR細(xì)胞中高表達(dá)的原因之一，Bcl-2表達(dá)的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。由于此次臨床樣本量較少的原因，通過構(gòu)建相關(guān)細(xì)胞株驗證相關(guān)結(jié)論。因此，后續(xù)仍需更多的標(biāo)本量和更嚴(yán)格的前瞻性臨床研究，進(jìn)一步探索白血病的耐藥及復(fù)發(fā)的分子機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)白血病耐藥提供潛在的作用新靶點，有助于為AML 患者的未來診斷、治療和預(yù)后開辟新的可能性。