CD20、Ki-67 及P53 蛋白在彌漫大B 細胞淋巴瘤中的表達及其臨床意義

蔣磊 周穎 王銀花 許倩

近年來彌漫大B 細胞淋巴瘤治療取得了較大進展，但仍有相當多的患者治療反應不敏感，治療后復發亦常有發生［1］。Ki-67、P53 均與彌漫大B 細胞淋巴瘤密切相關，而CD20 陰性彌漫大B 細胞淋巴瘤侵襲性較強且預后狀況較差［2-4］。由此可見，CD20、Ki-67 及P53 均可能與彌漫大B 細胞淋巴瘤病情和預后相關。聯合檢測多個基因蛋白表達可更全面準確進行預后判斷［5］。因此，本研究探討CD20、Ki-67 及P53 蛋白在彌漫大B 細胞淋巴瘤中的表達水平，并分析其對臨床病理特征及預后的判斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

分析2018 年3 月～2022 年3 月蘇州市第九人民醫院血液科收治的86 例彌漫大B 細胞淋巴瘤患者的臨床和病理學資料。其中男45 例，女41 例，平均年齡（53.68±9.85）歲，≥60 歲39 例，＜60 歲47 例，結外累及53 例，霍奇金淋巴瘤分期（staging of Hodgkin's lymphoma，Ann Arbor 分期）［6］為Ⅲ+Ⅳ分期患者55 例而Ⅰ+Ⅱ分期患者31 例，國際預后指數（international prognostic index，IPI 評分）［7］≥2 分39例而＜2 分47 例，東部腫瘤協作組體能狀態（Eastern Cooperative Oncology Group performance status，ECOG PS 評分）［8］≥2 分35 例而＜2 分51 例，漢斯（Hans）免疫分型為生發中心B 細胞型（Germinal center B cell，GCB）分型［9］30 例而ABC 分型56 例，骨髓浸潤48 例。

納入標準：符合WHO（2016）關于淋巴組織腫瘤修訂版相關分類標準［10］，淋巴結活檢確診為彌漫大B 細胞淋巴瘤。均為成年患者。確診后生存期＞6 個月。檢查完善且資料齊全。排除標準：合并壞死性淋巴炎、其他原發腫瘤疾病或轉移性腫瘤疾病、傳染性單核細胞增多癥、髓外白血病或全身重要臟器嚴重疾患者。患者均知情同意且研究經本院倫理委員會審核批準。

1.2 研究方法

采用免疫組化法檢測腫瘤石蠟組織中CD20、Ki-67 及P53 蛋白表達。將石蠟組織切制成4～5 μm 厚連續切片，80℃烤箱烤片半小時，二甲苯脫蠟和常規梯度酒精水化，檸檬酸緩沖液煮沸修復抗原，磷酸鹽（PBS）緩沖液沖洗，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性。向切片滴加一抗，在4℃恒溫箱中孵育過夜，PBS 緩沖液沖洗，滴加通用型免疫球蛋白G 抗體-辣根過氧化物酶多聚體，37℃恒溫箱中孵育15 min，PBS 緩沖液沖洗，行二氨基聯苯胺試劑染色、蘇木素輕度復染細胞核，PBS 緩沖液沖洗，梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封片。陰性對照為采用PBS 代替一抗。

由2 名以上病理學專家確定免疫組化病理結果。當腫瘤細胞內有定位清晰的棕黃色或棕褐色顆粒時判斷為陽性，隨機選取10 個視野（200×）觀察，確定著色強度和陽性細胞數量占比，其中沒有著色0 分，淺黃色1 分，棕黃色2分，棕褐色3 分；陽性細胞數占比＜25%1 分，25%～50% 2 分，＞50% 3 分，取著色強度和陽性細胞數量占比分值相乘分值結果，分值在0～1 分陰性（-），2～4 分弱陽性（+），5～8 分中等陽性（++），9～12 分強陽性（+++），中等陽性和強陽性均計入陽性表達［11］。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 彌漫大B 細胞淋巴瘤組織CD20、Ki-67 及P53 蛋白表達水平分析

CD20 蛋白表達定位于細胞膜，Ki-67、P53 蛋白表達均定位于細胞核。86 例彌漫大B 細胞淋巴瘤患者腫瘤石蠟組織中CD20、Ki-67 及P53 蛋白陽性表達率分別為38.37%（33/86）、82.56%（71/86）和80.23%（69/86）。見圖1。

圖1 彌漫大B 細胞淋巴瘤組織CD20、Ki-67 及P53 蛋白表達免疫組化檢測結果（SP，×200）Figure 1 Immunohistochemical detection results of CD20，Ki-67 and P53 protein expression in diffuse large B-cell lymphoma tissue（SP，×200）

2.2 不同CD20、Ki-67 及P53 蛋白表達情況患者的臨床病理參數和預后參數比較

CD20、Ki-67 及P53 蛋白陽性和陰性表達患者的Ann ArborⅢ+Ⅳ分期患者比例、IPI 評分≥2 分患者比例、ECOG PS 評分≥2 分患者比例、Hans GCB分型患者比例、骨髓浸潤發生率比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同CD20、Ki-67 及P53 蛋白表達情況患者的臨床病理參數和預后參數比較［n（%）］Table 1 Comparison of clinicopathological parameters and prognostic parameters in patients with different CD20，Ki-67 and P53 protein expressions［n（%）］

2.3 彌漫大B 細胞淋巴瘤患者CD20、Ki-67 及P53 蛋白陽性表達狀況的危險因素分析

彌漫大B 細胞淋巴瘤組織CD20、Ki-67 和P53蛋白表達均可影響其IPI 評分、ECOG PS 評分、Hans 分型、骨髓浸潤狀況（P＜0.05）。見表2 和表3。

表2 變量賦值Table 2 Assignment of arguments

表3 彌漫大B 細胞淋巴瘤患者CD20、Ki-67 及P53 蛋白表達狀況的危險因素分析Table 3 Analysis of risk factors for expression of CD20，Ki-67 and p53 protein of patients with diffuse large B-cell lymphoma

2.4 彌漫大B 細胞淋巴瘤組織CD20、Ki-67 及P53 蛋白表達情況對其臨床病理和預后狀況的判斷效能

彌漫大B 細胞淋巴瘤組織CD20、Ki-67 及P53蛋白表達情況對其IPI 評分、ECOG PS 評分、Hans分型、骨髓浸潤等的判斷效能均良好，以三者聯合判斷效能最佳。見表4。

表4 彌漫大B 細胞淋巴瘤組織CD20、Ki-67 及P53 蛋白表達情況對其臨床病理和預后狀況的判斷效能Table 4 The efficacy of CD20，Ki-67 and P53 protein expression in diffuse large B-cell lymphoma tissue for evaluating its clinicopathological and prognostic status

3 討論

彌漫大B 細胞淋巴瘤約占非霍奇金淋巴瘤的32.5%，具有侵襲性強的特點，可侵犯患者全身多個部位，患者預后情況差［12］。對彌漫大B 細胞淋巴瘤進行及時有效診治對改善其預后的重要意義，目前其治療以免疫化療為主，但有相當一部分患者腫瘤治療困難且可出現疾病復發情況的發生［13］。因此，改善彌漫大B 細胞淋巴瘤療效和預后仍是目前需解決的重要醫療問題。彌漫大B 細胞淋巴瘤的發生發展涉及多種機制和相關基因蛋白的異常表達，目前已發現多種基因蛋白參與其中［14］。通過相關因子檢測早期確定腫瘤病情惡化或不良預后風險，可為其治療方案調控優化和靶向治療提供參考。

Ki-67 是與多種腫瘤密切相關的核蛋白，可通過核糖體RNA 的轉錄影響細胞增殖活躍度，而張靜等［15］的研究免疫組化法檢測彌漫大B 細胞淋巴瘤患者癌組織和癌旁組織的Ki-67 蛋白的表達情況，結果表明其在彌漫大B 細胞淋巴瘤癌組織中異常高表達，且其癌組織中Ki-67 蛋白高表達甚至可作為患者不良預后的獨立危險因素。而本研究中彌漫大B 細胞淋巴瘤癌組織中的Ki-67 蛋白陽性表達率為82.56%，與張靜等［15］的研究中的90.14%差異不大，進一步確定了Ki-67 蛋白表達在彌漫大B 細胞淋巴瘤中的高表達。本研究中，Ki-67蛋白陽性表達患者的Ann ArborⅢ+Ⅳ分期患者比例、IPI 評分≥2 分患者比例、ECOG PS 評分≥2 分患者比例、Hans GCB 分型患者比例、骨髓浸潤發生率均高于其相應蛋白陰性表達患者，彌漫大B細胞淋巴瘤組織Ki-67 蛋白表達可影響其IPI 評分、ECOG PS 評分、Hans 分型、骨髓浸潤狀況，而診斷性試驗四格表分析肯定了彌漫大B 細胞淋巴瘤組織Ki-67 蛋白表達情況對其IPI 評分、ECOG PS 評分、Hans 分型、骨髓浸潤等的判斷效能。

P53 基因調控細胞周期組織、衰老、凋亡等過程，且彌漫大B 細胞淋巴瘤中P53 蛋白陽性表達為其獨立預后因素，可作為其預后評估指標［16］。本研究中彌漫大B 細胞淋巴瘤組織中P53 蛋白陽性表達率較高，且蛋白陽性表達和陰性患者的Ann ArborⅢ+Ⅳ分期患者比例、IPI 評分≥2 分患者比例、ECOG PS 評分≥2 分患者比例、Hans GCB 分型患者比例、骨髓浸潤發生率有較大差異，彌漫大B細胞淋巴瘤組織P53 蛋白表達可影響其IPI 評分、ECOG PS 評分、Hans 分型、骨髓浸潤狀況且P53 蛋白表達對其IPI 評分、ECOG PS 評分、Hans 分型、骨髓浸潤等具有較好的判斷效能。

CD20 陰性的彌漫大B 細胞淋巴瘤臨床較少見，但是CD20 陰性的彌漫大B 細胞淋巴瘤具有更強的腫瘤侵襲性，患者預后情況也更差［17］。本研究中，彌漫大B 細胞淋巴瘤組織CD20 陰性表達患者比例為38.37%，且相對于CD20 陽性患者，CD20陰性患者的Ann ArborⅢ+Ⅳ分期患者比例、IPI 評分≥2 分患者比例、ECOG PS 評分≥2 分患者比例、Hans GCB 分型患者比例、骨髓浸潤發生率均更高，彌漫大B 細胞淋巴瘤組織CD20 蛋白表達可影響其IPI 評分、ECOG PS 評分、Hans 分型、骨髓浸潤狀況，且對其IPI 評分、ECOG PS 評分、Hans 分型、骨髓浸潤等的判斷效能均良好，CD20、Ki-67 及P53 蛋白表達三者聯合判斷彌漫大B 細胞淋巴瘤臨床病理和預后狀況的效能最佳，提示CD20、Ki-67 及P53 蛋白聯合檢測在彌漫大B 細胞淋巴瘤中具有更佳的應用價值，可更好地指導彌漫大B細胞淋巴瘤診治，從而改善療效和預后。

綜上所述，在彌漫大B 細胞淋巴瘤中Ki-67 及P53 蛋白陽性水平較高而CD20 蛋白陰性表達，三者與患者臨床病理和預后狀況均密切相關且聯合應用可更好判斷其臨床病理和預后狀況，但本研究尚不能確定三者可作為彌漫大B 細胞淋巴瘤靶向干預基因，仍需更多的基因干預實驗確定其可能性。