中性粒細胞胞外誘捕網在急性缺血性腦卒中的研究進展

徐躍軒 趙曉麗

急性缺血性腦卒中又稱急性腦梗死，是指各種腦血管病變所致腦部血液供應障礙，導致局部腦組織缺血、缺氧性壞死而迅速出現相應神經功能缺損的一類臨床綜合征。據全球疾病 負 擔 2017（Global Burden of Diseases2017，GBD2017）顯示，缺血性腦卒中是世界范圍內死亡和永久性殘疾的主要原因之一［1］。在美國，每年有近70 萬人經歷新發或復發性缺血性卒中，有3%的美國人口受到卒中的影響，卒中已成為美國第五大死亡原因［2］。我國住院急性缺血性腦卒中患者發病后3 個月時病死率9%～9.6%，致死/殘疾率為34.5%～37.1%［3］。最近有研究發現活化的中性粒細胞產生的中性粒細胞胞外誘捕網（Neutrophil extracellular traps，NETs）可以捕獲微生物以阻止其傳播，并可以保持局部高濃度的抗菌藥物以降解毒素、殺滅細菌［4］。但近來有研究證實NETs 與急性缺血性腦卒中的發生發展有關［5］。本文將圍繞NETs的形成及其在急性缺血性腦卒中的意義進行概述。

1 NETs 概述

1.1 NETs 的發現及構成

2004 年Brinkmann 等［4］人首次發現了活化的中性粒細胞會向胞外釋放一種由解聚的DNA 及多種顆粒蛋白組成的纖維網狀結構，即NETs。NETs 的主要成分為DNA，主要蛋白質成分為組蛋白（Histone，H），主要是組蛋白H2A，H2B，H3 和H4，其他蛋白質成分包括中性粒細胞彈性蛋白酶（Neutrophil elastase，NE）、髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）、乳鐵蛋白、凝膠酶、防御素、鈣衛蛋白和抗菌肽等［4］。

1.2 NETs 的形成機制

Brinkmann 等［4］人發現NETs 在中性粒細胞激活后10 分鐘形成，其進程早于細胞凋亡。Fuchs 等人認為NETs 形成不同于細胞凋亡和壞死，是一種新的中性粒細胞的死亡方式［6］。研究表明，誘導NETs 形成的因素諸多，如細菌、病毒、真菌、白介素-8、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、自身抗體、佛波酯（Phorbol myristate acetate，PMA）等均可誘導NETs 形成。

近年來的研究證實，不同的誘導因素所介導的NETs 形成方式也有所不同。其中最為經典且研究最為詳細的為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴性活性氧（Reactive oxygen species，ROS）途徑。Fuchs 等人證實了NETs 形成依賴于NADPH 產生的ROS［6］。在PMA 或者LPS 等刺激因素作用下，在NADPH 酶生成的ROS 和鈣離子的作用下，蛋白精氨酸去亞胺酶4（Peptidylarginine deiminase 4，PAD4）誘導中性粒細胞的組蛋白H3瓜氨酸化及染色質結構改變，導致染色質去聚化，ROS 作為第二信使作用于MPO 和NE 從胞質顆粒遷移到細胞核內，增強染色質去聚化及促使核膜破裂，進而導致中性粒細胞釋放解聚的核DNA 及相關顆粒蛋白組成NETs［7-9］。同時，Li 等［8］人的研究表明PAD4 的活性對于NETs 的形成也至關重要［9］。Hakkim 等人證實Raf-MEK-ERK 通路位于NADPH 氧化酶的上游，參與了NETs 的形成。Kang 等［10］人證實了銀納米粒子（AgNPs）也是通過NADPH 依賴ROS 途徑誘導NETs 形成。

其他誘導途徑如金黃色葡萄球菌可以激活Toll 樣受體2（Toll like receptor 2，TLR2）及補體途徑誘導NETs 形成，但需要TLR2 和補體同時存在，單獨的TLR2 或補體存在均不能誘導NETs 形成［11］。金黃色葡萄球菌還可以通過一些成孔毒素如γ 溶血素在中性粒細胞核膜上形成孔，誘導組蛋白、含有MPO 和NE 的顆粒蛋白釋放到胞外來刺激NETs 形成［12］。除此之外，肌動蛋白骨架重排、梗死灶周圍的酸堿環境、氧濃度和鐵離子也可能影響NET 的形成［5，13］。

1.3 NETs 的檢測

NETs 的結構比較復雜，至今尚未統一檢測指標及方法，但在近些年的研究中，瓜氨酸組蛋白H3（Citrullinated histone H3，citH3）被 普 遍 用 于NETs 的檢測，通常用citH3 的含量代表NETs 的含量［14-15］。除此以外，由中性粒細胞產生的游離胞外DNA（Cell-free DNA，cfDNA）作為NETs 的主要成分也常用于NETs 的檢測，而NE、MPO 等NETs 的蛋白組分也被廣泛應用于NETs 的雙通道檢測。

2 NETs 的分類

根據中性粒細胞的形態變化，NETs 可分為三種類型：①suicidal NETosis：由細胞溶解性死亡釋放NETs，細菌、真菌、病毒、PMA、白介素-8 等誘導中性粒細胞通過NADPH 依賴性ROS 途徑釋放解聚的核DNA 及相關顆粒蛋白組成的NETs，通常在2～20 小時內發生；②Vital NETs：由活細胞將NETs通過囊泡運輸的方式釋放至胞外，金黃色葡萄球菌誘導中性粒細胞通過依賴TLR2 途徑釋放核DNA等組成的NETs，通常在10～60 分鐘內發生；③mitochondrial NETs：由活細胞釋放的NETs，經過粒-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）預處理，中性粒細胞在LPS 或補體因子5a 刺激下釋放由線粒體DNA組成的NETs，通常在15～20 分鐘內發生［16］。

3 NETs 在急性缺血性腦卒發生中的作用

依據局部腦組織發生缺血壞死的機制可將缺血性腦卒中分為三種主要病理生理學類型：腦血栓形成（Cerebral thrombosis）、腦栓塞（Cerebral embolism）和血流動力學機制所致的缺血性腦卒中。腦血栓形成和腦栓塞均是由于腦供血動脈急性閉塞或嚴重狹窄所致，約占全部急性腦梗死的80%～90%。最近，大量的研究發現NETs 與腦血栓形成有關［5，17］。

3.1 NETs 在動脈粥樣硬化中的作用

動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的常見病因，其隨著年齡的增長而加重，高齡、高血壓病、高脂血癥、吸煙、糖尿病是其重要的危險因素。近年來，有研究證實NETs 可以促進動脈粥樣硬化的發展。NETs 形成后反饋誘導DNase 反應，這也是NETs 清除的重要機制。Dhawan 等［18人發現高固醇血癥會損害Apoe-/-小鼠的DNase 反應，導致NETs 清除延遲并加重炎癥，通過外源性補充DNase1 清除NETs 后，炎癥減輕并出現了有益的動脈粥樣硬化斑塊重塑］，這表明了調節NETs 在體內的水平可能成為延緩或阻止動脈粥樣硬化進展的治療手段。

3.2 NETs 在腦血栓形成中的作用

血栓形成是在某些誘導因素下血液中的有形成分聚集，形成固體質塊的過程。近年來大量的研究證實NETs 在血栓形成部位存在，為血栓的組分之一［19-20］。

2017 年Laridan 等［19］人采用免疫組化及免疫熒光染色法首次證實了缺血性腦卒中的血栓中存在NETs，且其為缺血性腦卒中的血栓的共同組分。2018 年Ducroux 等［20］的研究表明，所有急性缺血性腦卒中的血栓均含有NETs，且NETs 主要位于血栓的外層。2020 年Novotny 等［21］人的研究也證實了急性缺血性腦卒中的血栓中百分百含有NETs。2022 年Li 等［5］人的研究表明中性粒細胞和NETs 存在于缺血損傷后梗死灶同側的血管周圍，在缺血后1～3 天達到峰值。基于這些發現，目前關于急性缺血性腦卒中的研究方向和研究熱點有所轉移，如NETs 如何影響血栓形成。

大量的研究證實NETs 通過以下途徑促進血栓形成：①NETs 對內皮細胞具有細胞毒性，并與血管性血友病因子（Von Willebrand Factor，VWF）等共同促進高凝狀態［22］；②NETs 為血小板、紅細胞和促凝劑分子提供骨骼支持，以促進血栓形成［23］；③NETs 中包含的蛋白質成分激活內源性凝血途徑，如血小板可以增強中性粒細胞釋放NETs，在組蛋白等的作用下，誘導凝血因子FXII（Coagulation factor FXII，FXIIa）依賴性凝血，進而促進血液的高凝狀態［22，24］。組蛋白釋放到循環后，還可以在凝血因子FXIII（Coagulation factor FXIII，FXIIIa）等的作用下與纖維蛋白交聯，促進凝血和增加凝塊的穩定性，導致動脈、靜脈和微血管血栓形成［25］。

4 NETs 在急性缺血性腦卒中預后中的作用

2017 年Vallés 等人研究表明急性缺血性腦卒中患者的citH3 水平顯著升高與下列因素相關，如年齡較大、血糖水平升高、房顫史、心栓塞性卒中和卒中嚴重程度升高［5］。這表明血漿中citH3 水平可能作為腦卒中患者的預后衡量指標，同時也可作為腦卒中患者的評估卒中嚴重程度的指標。2019 年Lim 等［26］人通過測量急性缺血性腦卒中患者血漿中的雙鏈DNA（dsDNA）和DNA-組蛋白復合物的濃度來評估NETs 的含量，證實了急性缺血性腦卒中患者在初始階段時NETs 的水平升高。與此同時，Lim 等使用ROC 曲線分析dsDNA 濃度在急性缺血性腦卒中初始階段是否是有效的標記物，計算得到AUC 值為0.859，即dsDNA 濃度在急性缺血性腦卒中初始階段是有效的標記物。但此研究存在方法學上的局限性，結論的準確性還需進一步探索。

5 NETs 在急性缺血性腦卒中治療中的意義

2021 年Genchi 等［27］對80 例缺血性腦卒中患者經血管內機械取栓提取的人腦血栓進行組織學分析，描述了NETs 的組成并采用免疫組化染色法測定了血栓NETs 含量及采用ELISA 法測定了血漿NETs 含量，結果發現量化NETs 可以區分心源性栓塞性卒中和大動脈粥樣硬化性卒中。此前Laridan 等［19］人的研究中也發現心源性栓塞性卒中的NETs 含量為非心源性栓塞性卒中的兩倍。這為臨床正確的區分缺血性腦卒中的類型提供了有力的支撐，后續的治療也將更加具有針對性。但目前的結論大多建立在動物模型之上，進一步的探索將具有重大的臨床意義。Dhawan 等［27］人通過外源性補充DNase1 糾正了DNase 反應缺陷的情況也表明了NETs 作為新興的治療靶點可能性。

6 總結

從上述的研究和討論中可以明顯看出NETs與血栓形成的關系及其在急性缺血性腦卒中的發生發展中的作用。目前急性缺血性卒中溶栓治療的成功率較低，更加深入地了解急性缺血性腦卒中的血栓形成就至關重要。此外，關于急性缺血性腦卒中血栓的研究對于腦血栓的靶向治療的進展也極其重要。

目前關于NETs 的研究報道較少，其在急性缺血性腦卒中發生發展中的作用機制尚未完全闡明，但根據目前的研究成果，NETs 在急性缺血性腦卒中的作用有進一步的臨床研究價值，需要深入的探索與研討。NETs 除了與急性缺血性腦卒中的發生有關，還與其他血栓性疾病、自身免疫性疾病、膿毒血癥、腫瘤、牙周炎的發生發展有關。綜上所述，更加深入細致地研究NETs 形成的確切機制，以及NETs在疾病發生發展中扮演的角色，對于闡明疾病的發生機制及發現新的診療手段具有重要的臨床意義。