血小板輸注無效患者外周血T、B、NK 細胞和血小板抗體表達

張玲 孫慶正 王曉珍 劉加軍

血小板輸注是指通過補充外源性血小板，從而預防和治療血小板功能異常或者血小板數量下降引起的出血。血小板輸注是目前治療各種血液病的有效支持治療［1］。但血小板輸注過程中可能會出現血小板輸注無效（platelet transfusion refractoriness，PTR），尤其常見于反復多次輸血小板這類患者中，發生率約38.3%至40.9%，患者血小板數量未見提高，出血癥狀無明顯改善［2-4］。本研究擬通過分析血小板輸注無效患者外周血中T、B、NK 細胞比例和血小板特異性抗體表達，探討其在血小板輸注無效中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

以2018 年1 月至2021 年12 月中山大學附屬第三醫院收治的22 例血小板輸注無效的患者作為研究對象，其中急性髓系白血病（AML）14 例，急性淋巴細胞白血病（ALL）8 例，男8 例，女14 例，平均年齡（46.09±3.253）歲。以33 例輸注有效的患者作為對照組，其中急性髓系白血病（AML）24 例，急性淋巴細胞白血病（ALL）9 例，男18 例，女15 例，平均年齡（43.67±3.24）歲。 納入標準：①急性髓系白血病或者急性淋巴細胞白血病；②簽署知情同意書。排除標準：①脾功能亢進，抗血小板藥物，彌散性血管內凝血（DIC）等引起的血小板輸注無效；②缺失重要診療信息的患者。所有患者均簽署知情同意書。該研究符合中山大學附屬第三醫院相關倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 患者外周血T、B、NK 淋巴細胞比例檢測

留取EDTA 抗凝管2 mL 外周血，PBS 液洗滌后調整細胞數至（1～10）×109/L；按比例分別加人CD19、CD3、CD4、CD8、CD56 和CD45 抗體（Becton Dickinson 公司），室溫避光孵育20 min；然后再加入紅細胞裂解液，避光孵育10 min，用PBS 液洗滌，離心后棄上清；加入500 μL PBS 液重懸細胞，上機檢測，以CD45-SSC 設門圈出淋巴細胞，計算T 淋巴細胞亞群（CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+）比例，B 淋巴細胞（CD19+），NK 細胞（CD56+）比例。

1.2.2 血小板特異性抗體檢測

血小板表面攜帶有血小板特異性抗原（HPA），通過固相凝集法檢測血小板特異性抗體（HPA 抗體），留取EDTA 抗凝管2 mL 外周血，4 000 rpm，離心半徑為16.3 cm，離心5 分鐘后取上層血漿，凍存至負80 度冰箱待檢。按照血小板抗體檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 統計學分析

采用SPSS 26.0 進行統計學處理。計數資料采用n（%）表示，用χ2檢驗。計量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血小板特異性抗體表達情況比較

無效組血小板特異性抗體表達陽性率明顯高于有效組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 血小板輸注患者血小板特異性抗體表達情況［n（%）］Table 1 The expression of platelet specific antibody in patients received platelet transfusion［n（%）］

2.2 流式細胞術檢測患者外周血T、B、NK 淋巴細胞比值

與有效組相比較，無效組患者外周血B 細胞升高，CD3+CD4+T 淋巴細胞下降，CD3+CD8+T 淋巴細胞升高，CD4+/CD8+比值下降，CD3+T 淋巴細胞和NK 細胞比例，兩組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2、圖1。

圖1 血小板輸注患者外周血T、B、NK 細胞比例（%）Figure 1 The Proportion of T，B and NK cells in peripheral blood of patients received platelet transfusion（%）

表2 血小板輸注患者外周血T、B、NK 細胞比例（%）Table 2 The Proportion of T，B and NK cells in peripheral blood of patients received platelet transfusion（%）

3 討論

血小板輸注是治療血小板減少的有效手段。在需要長期血小板支持性治療的患者中，血小板輸注無效（platelet transfusion refractoriness，PTR）是常見的臨床棘手問題，其發生時，外源性輸入的血小板迅速被破壞，嚴重時可危及生命。血小板輸注無效是指連續兩次或者兩次以上輸注血小板，輸注后10 分鐘至1 小時，血小板計數增加指數＜5×109/L［5］。

PTR 發生的常見原因包括非免疫因素和免疫因素。非免疫因素主要為機體出現發熱、服用抗血小板藥物、脾功能亢進、彌散性血管內凝血（DIC）等，導致血小板消耗過多或破壞增加，從而引起血小板輸注無效。這些可通過祛除病因和對癥治療來提高血小板輸注效果［6］。免疫性因素主要指同種異體免疫，即輸注的外源性血小板，作為同種異體抗原，誘發機體的同種異體免疫反應，從而導致血小板輸注無效［7-8］。

血小板表面攜帶人類白細胞抗原（HLA）、血小板特異性抗原（HPA），可產生的HPA 抗體、HLA抗體和HLA/HPA 復合抗體，這些抗體是導致無效輸注發生的主要原因［9-12］。在本研究中我們分析了血小板輸注無效組和有效組血小板特異性抗體（抗HPA 抗體）的表達，發現無效組血小板特異性抗體陽性率明顯高于有效組（86.36% vs 15.15%，P＜0.01），提示血小板特異性抗體在血小板輸注無效中發揮重要作用，與研究報道相符［13］。臨床上通過檢測血小板特異性抗體及輸注配型血小板有助于預防血小板輸注無效的發生。

血小板輸注后引起的同種異體免疫需要啟動和激活特異于源自血小板抗原肽的CD4+T 細胞，CD4+T 細胞激活后反過來刺激B 淋巴細胞，B 細胞進一步分化成漿細胞，漿細胞產生免疫球蛋白G（IgG）抗體，這些抗體可結合血小板表面，從而導致血小板輸注無效［14］。

目前關于機體產生同種免疫反應的機制尚不清楚。因此，我們分析了血小板輸注患者外周血T、B 和NK 細胞比例，以探討血小板輸注無效可能的免疫機制。研究發現，血小板輸注無效患者外周血中B 淋巴細胞比例升高，B 淋巴細胞可能進一步分化為漿細胞，產生血小板抗體從而引起血小板輸注無效，提示臨床上可使用利妥昔單抗提高血小板輸注效果。

T 淋巴細胞在機體細胞免疫和體液免疫中發揮重要作用，CD3 僅存在于T 淋巴細胞表面，參與抗原識別和信號轉導。T 淋巴細胞亞群分為輔助性T 淋巴細胞和細胞毒性T 淋巴細胞，CD4 為輔助性T 淋巴細胞的主要標記，具有刺激B 淋巴細胞分化為漿細胞，輔助T 淋巴細胞轉化成效應細胞。CD8為細胞毒性T 淋巴細胞的主要標記，通過分泌細胞因子參與細胞免疫。本研究通過CD45 設門圈出淋巴細胞，CD3 標記T 淋巴細胞，然后通過CD4，CD8標記CD3+CD4+T 淋巴細胞，CD3+CD8+T 淋巴細胞，分析T 淋巴細胞亞群變化，發現PTR 患者較有效組CD3+CD8+T 細胞比例增高，而CD3+CD4+T 細胞比例減低，提示CD8 陽性T 淋巴細胞在血小板輸注無效中發揮重要作用，與研究報道相符［15］。CD4 陽性T 細胞與CD8 陽性T 細胞的比值保持動態平衡，從而維持機體的細胞免疫。本研究發現血小板輸注無效患者CD4+/CD8+比值下降，T 淋巴細胞比例失衡，CD8+T 淋巴細胞增高，促進B 細胞活化產生抗體，從而導致血小板輸注無效。

NK 細胞稱自然殺傷細胞，是機體重要的免疫細胞，CD56 是NK 細胞的表面標志物。目前關于NK細胞在PTR 中的作用尚不明確，本研究尚未觀察到NK 細胞在血小板輸注中的差異，可能與本研究樣本量偏少有關，未來尚需擴大樣本量進一步明確NK細胞在血小板輸注無效中的作用及可能的機制。

綜上所述，血小板特異性抗體表達，T、B 淋巴細胞異常在血小板輸注無效中發揮重要作用，但其具體作用機制尚不明確。進一步探討血小板輸注無效的發生機制，有助于預防和治療血小板輸注無效。