MiR-129-5p 在肺腺癌中的表達及其臨床意義

張建海 王巍 王前 許佳倫 高娜

肺癌是國內第一大癌癥疾病，死亡率也位居所有癌癥之首，5 年以上存活率僅18%［1］。由于肺癌患者早期癥狀普遍不明顯，實驗室指標也不具特異性，導致肺癌臨床診斷存在一定困難，目前臨床對于肺癌的診斷主要通過影像學及病理學檢查，其中以病理活檢診斷準確率最高，是診斷肺癌及其分型的金標準，但該診斷方式具有有創性，臨床應用存在一定的局限性［2］。環狀RNA（circular-RNA，circRNA）是近年來發現的一種新型競爭性內源性RNA（ceRNAs），其在生物體內含量較為豐富，主要由mRNA 前體（pre-mRNA）經反向剪接環化而形成，具有穩定性、保守性、普遍性、組織和疾病特異性的特點，有望成為一種癌癥診斷及預后的生物學標志物［3］。近年來，相關文獻報道了circRNA 應用于胃癌、乳腺癌及神經膠質瘤等多種癌癥診斷及患者預后評估方面的價值［4-5］。本實驗對肺腺癌患者組織中差異性表達的環狀RNA 進行篩選及驗證，以初步探討MiR-129-5p 作為肺腺癌早期診斷分子生物標志物的價值。

1 對象與方法

1.1 臨床標本

收集2014 年1 月至2017 年1 月年度北京市大興區中西醫結合醫院的50 例肺腺癌病人的外周血液樣本10 mL（肺腺癌組），同時選取門診體檢的健康志愿者30 名（健康對照組），抽取外周血液10 mL。肺腺癌患者，納入標準：術中、醫院病理學檢查確診為浸潤性腺癌，排除標準：①病理學診斷為非腺癌或混合型癌，依據第八版腫瘤TNM 分期標準進行腫瘤分期；②在采血之前，接受過任何手術、化療、放療；③合并肺結核、高血壓、冠心病等基礎疾病；④病歷資料不完全。患者均簽署知情同意書，本研究通過了北京市大興區中西醫結合醫院的倫理委員會批準。

1.2 樣品收集

抽取患者10 毫升血液并放置于三個試管中；其中一個含有用于全血細胞計數（Whole blood cell count，WBC）的 乙 二 胺 四 乙 酸（Ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA），第二個含有用于凝血酶原時間（prothrombin time，PT）測量的檸檬酸鈉，第三個離心管用于血清分離。血清用于測定所有血清學測試，包括ELISA 和分子生物學技術。

1.3 RNA 提取

使用Qiagen（Valenica，CA）試劑盒從血清中提取RNA。RNA 濃度由NanoDrop2000（ThermoScientific）測定。

1.4 逆轉錄反應

使用Qiagen 通過RT-PCR 試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA。使用miScriptSYBRGreenPCRKit（Qiagen）試劑盒通過實時RT-PCR 擴增cDNA 模板。使用轉子基因QSystem（Qiagen）進行定量PCR（qPCR）。而MiR-129-5p 的基因表達被標準化 為SNORD68 表 達。通 過2-δδCt 方 法 計 算RNA 的相對表達。MiR-129-5p 的引物由德國Qiagene 公司提供。用于擴增NEAT1 基因表達的引物是（776716R5485）：正向50-TGGCTAGCTCAGGGCTTCAG-30 和反向50-TGAAAACCTTTACCCCAGGA-30（Invitrogen）。

1.5 定量實時PCR（qRT-PCR）

使用TRIzol 試劑從培養的細胞中提取總RNA。 使 用 總 RNA 用 cDNA 合 成 試 劑 盒（FastQuantRT 試劑盒，中國北京天根）合成cDNA。根據制造商的建議，使用SuperRealPreMixPlus（天根）進行qRT-PCR。用于qRT-PCR 的所有引物的序列列于補充表1。所有實驗均以三份形式進行。β-actin 和U6 表達分別用于mRNA 和MiR-129-5p 表達的正常化。使用2-ΔΔCt 方法確定了相對表達水平。

1.6 隨訪

術后追蹤病人全部經門診或電話追蹤，直至2022 年1 月份，并進行5 年的整體生存統計。

1.7 統計分析

2 結果

2.1 兩組MiR-129-5p 表達水平比較

肺腺癌組MiR-129-5p（0.92±0.06）的表達水平低于對照組（0.18±0.07），比較差異有統計學意義（t=48.215，P＜0.001）。見圖1。

2.2 MiR-129-5p 表達與肺腺癌患者臨床病理特征的關系

MiR-129-5p 表達與肺腺癌分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、年齡（＞60 歲與＜60 歲）、TNM 分期、浸潤深度、表皮生長因子受體（Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）基因突變有關（P均＜0.05），與患者性別、吸煙與否、腫瘤大小無關（P＞0.05）。見表1。

表1 MiR-5129-55p 表達與肺腺癌患者臨床病理特征的關系Table 1 Relationship between MiR-5129-55p expression and clinicopathological features of patients with lung adenocarcinoma

2.3 生存分析顯示

以肺腺癌血清中MiR-129-5p 表達的中位數為基準，將肺腺癌分為高、低表達組。MiR-129-5p 高表達組5 年總生存率高于MiR-129-5p 低表達組（P＜0.05）。Cox 回歸分析發現，肺腺癌分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期、浸潤深度和MiR-129-5p 表達是肺腺癌患者預后的獨立風險因素。見圖2、表2。

圖2 MiR-129-5p高低表達肺腺癌患者5年生存率K-M 分析Figure 2 K-M analysis of 5-year survival rate of patients with high and low expression of MiR-129-5p in lung adenocarcinoma

表2 肺腺癌患者預后的風險因素分析Table 2 Analysis of prognostic risk factors in patients with lung adenocarcinoma

圖2 MiR-129-5p 相關的ROC 曲線Figure 2 The ROC curve of MiR-129-5p

2.4 MiR-129-5p 對肺腺癌的診斷效率

通過繪制ROC 曲線（n=80），包括肺腺癌組=50 例，健康對照組=30 例，MiR-129-5p 診斷肺腺癌的敏感性為65.6%，特異性為75.0%，AUC=0.751，P=0.002，臨 界 值0.452，95%CI為0.613～0.887。

3 討論

肺腺癌是原發性肺癌較為常見的一種亞型，其屬于腺上皮惡性腫瘤，具有眾多的組織學分類，可以以腺泡、細支氣管肺泡、乳頭等形式存在。有研究報道，腫瘤標志物的水平高低可以預測瘤體的大小和TNM 分期［6］。此外，首次診斷或治療前升高的標志物水平也可以用于監測后續的治療效果和預后判斷。

隨著基因組測序技術的快速發展，近年來越來越多不具備蛋白質編碼功能的RNA 被發現。MiRNA 是一類長19～25 個核苷酸的內源性非編碼小RNA，多位于腫瘤相關的脆性位點或基因區域，其能夠與具備蛋白質編碼功能的信使RNA 結合廣泛參與腫瘤病理生理過程［7-8］。MiR-129-5p 由MiR-129-1 和MiR-129-2 協同轉錄而成，近年來，有研究報道［9］顯示，MiR-129-5p 可在多種惡性腫瘤中發揮重要作用。在胃癌中，miR-129-5p 可通過靶向白細胞介素-8 參與胃癌細胞的遷移和入侵。在乳腺癌中，miR-129-5p 通過靶向HMGB1 來減弱輻照誘導自噬，并降低乳腺癌細胞的輻射抵抗力；miR-129-5p 是腫瘤生長的抑制劑。但在喉癌組織中MiR-129-5p 表達則顯著上調，其主要是通過靶向作用于含WW 結構域的E3 泛素蛋白連接酶1 而促進癌細胞增殖和浸潤。MiR-129-5p 在肺癌組織中表達顯著下調，其主要通過靶向抑制肺癌組織中血管內皮生長因子的生成而發揮對癌細胞遷移和侵襲能力的抑制作用。MiR-129-5p 在肝癌組織中表達下調，上調其表達可提升其對鈣調蛋白依賴性蛋白激酶4 的調節作用，進而進一步起到對癌細胞增殖、遷移、浸潤的抑制作用［10-11］。本研究結果提示，MiR-129-5p 在肺腺癌細胞中表達顯著下調，明顯低于健康對照組患者，由此推測，MiR-129-5p 與肺腺癌疾病發生、進展、預后可能存在某種關系，可通過調控下游靶基因，從而發揮促癌或抑癌的作用，具有成為診斷肺腺癌的生物標志物潛力。

進一步驗證其在肺腺癌血液中表達水平與臨床病理特征的相關性及對肺腺癌診斷效率分析。研究發現，擴大樣本量進行qRT-PCR 發現，MiR-129-5p 表達水平與肺腺癌分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、年齡、TNM 分期、浸潤深度、EGFR 基因突變有關，但在患者性別、吸煙與否、腫瘤大小未見顯著性差異。它與分化程度呈負相關，分化程度越高，表達水平就越低，這表明miR-129-5p在肺腺癌的發生和進展中起著重要作用。此外，它與TNM 分期、浸潤深度、EGFR 基因突變呈負相關；表達水平越低，疾病的嚴重程度就越高，這表明miR-129-5p 可用于判斷疾病的嚴重程度。

胡俊華等［12］發現MiR-129-5p 可能成為結腸癌新的治療靶點。MiR-129-5p 表達可能會對腫瘤化療敏感性產生影響。Lu 等［13］發現，MiR-129-5p 通過下調RpS6，使Her-2 陽性乳腺癌對曲妥珠單抗過敏。Ma 等［14］研究報告稱，MiR-129-5p 通過直接靶向DLK1 來抑制NSCLC 和化療耐藥性。Zeng等［15］發現，microRNA-129-5p 通過靶向SOX2 抑制乳腺癌中的阿霉素耐藥性。基于上述研究，我們可以確認MiR-129-5p 可能成為肺腺癌預后的潛在生物標志物，但MiR-129-5p 在肺腺癌中的作用機制仍不清楚。本研究發現MiR-129-5p 低表達患者的5 年存活率明顯下降，預后不佳。此外ROC 曲線提示MiR-129-5p 對肺腺癌的診斷準確度高，這表明MiR-129-5p 相對表達水平對評估肺腺癌診斷、預后和癌癥治療療效具有重要價值。

本研究從表達水平、與臨床病理特征、預后關系等多方面研究了miR-129-5p 在肺腺癌患者血液中的表達水平，為臨床研究提供了參考。但研仍存在一些局限性，僅側重于血清學以探索其價值，過于單一。且由于肺腺癌5 年以上存活率低，隨訪時間短，加上治療差異，miR-129-5p 與肺腺癌患者長期生存預后之間的關旭仍需進一步研究。總之，肺腺癌組織中MiR-129-5p 低表達，其表達變化與肺腺癌發生發展及預后有關；血清MiR-129-5p 可用作肺腺癌癌癥診斷和預后的潛在生物標志物。