丙泊酚抑制肝癌細胞增殖和遷移的作用及其鐵死亡通路機制的研究

陶磊 王迪 疏樹華★

丙泊酚（Propofol，2，6-diisopropylphenol）是烷基酸類短效靜脈麻醉藥物，多用于全身性麻醉誘導及維持，具有誘導時間短和蘇醒快的優點，廣泛用于腫瘤根治術的全身麻醉［1］。近年來研究發現，丙泊酚可以抑制部分腫瘤的生長［2-4］，但是機制還不是很清楚，現已成為臨床上研究的熱點和難點方向之一。鐵死亡（Ferroptosis）是近年來發現的一種調節性細胞死亡方式，它由鐵依賴性脂過氧化驅動，主要特征包括：鐵失調、活性氧（reactive oxygen species，ROS）累積、谷胱甘肽水平降低和谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）失活等，參與多種病理生理過程和疾病的發生發展，包括肝癌［5-6］。肝癌是常見的惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、惡性度高、進展快、預后差和死亡率高等特點，目前尚無治療特效藥。本文揭示丙泊酚抑制肝癌細胞的增殖和遷移與鐵死亡的活性密切相關，為未來有效地應用丙泊酚進行抗肝癌治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HepG2 和Huh7 肝癌細胞株購自武漢普諾賽生物科技有限公司；細胞培養基高糖DMEM、青霉素-鏈霉素、胰酶等購買自合肥Biosharp 公司；胎牛血清購買自依科賽公司；丙泊酚購買自美國Sigma-Aldrich 公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購買自上海生工；β-TUBULIN、SLC3A2、GPX4、SLC7A11 等抗體購自武漢ProteinTech 或成都正能等公司；Ferrostatin-1 和RSL3 購買自美國Selleck 公司；CCK8 試劑購自美國APExBIO 公司；Transwell 小室購買自美國康寧公司；ROS 檢測試劑盒購買自碧云天；生物安全柜和細胞培養箱等購自美國Thermo Scientific 公司；倒置顯微鏡購買自德國徠卡公司；酶標儀購買自美國Molecular Devices 公司。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細胞的培養

HepG2 和Huh7 肝癌細胞的培養基成份為DMEM，里面添加10%胎牛血清以及1%青霉素-鏈霉素溶液，細胞在37℃、含5% CO2的細胞培養箱中培養，當細胞生長密度達70%～80%時，用0.25%胰酶消化，按照1∶3 的比例進行傳代培養。

1.2.2 藥物處理細胞

丙泊酚、Ferrostatin-1 和RSL3 溶解在dimethyl sulfoxide（DMSO）中，根據需要配成不同濃度的母液。對照細胞用DMSO 處理，實驗組細胞則用10 μg/mL 丙泊酚處理48 h；對于鐵死亡干預實驗，則在丙泊酚處理細胞時分別添加終濃度為10 μM 的Ferrostatin-1 和3 μM 的RSL3。

1.2.3 CCK8 實驗

各組細胞以相同的密度（約3×104）接種于96 孔板，當細胞密度細胞到達60%～70%時，進行藥物干預處理。48 h 后，每孔中加入10 μL 的CCK8 試劑繼續避光培養4 h，經酶標儀檢測450 nm 處光密度（optical density，OD）值，每組實驗重復三個孔。

1.2.4 Transwell 實驗

用無血清培養基重懸對照組和實驗組細胞，調整細胞濃度至8×105個/mL，吸取100 μL 的細胞懸液置于24 孔板上室，下室加入500 μL 含有10%胎牛血清的完全培養基，將培養板置于37℃、5%CO2培養箱中孵育36 h 或48 h，取出Transwell 嵌套的小室，用4% 多聚甲醛固定，再經0.1%結晶紫染色10 min，用棉簽輕輕拭去上室細胞，在顯微鏡下隨機選取3～5 個視野，觀察并拍照。

1.2.5 Western blot 檢測

收集對照組和丙泊酚處理組細胞，用PBS 洗滌后加入RIPA 溶液裂解細胞，BCA 法定量蛋白濃度。用10%的SDS-PAGE 膠分離蛋白質，每孔添加80 μg蛋白，經PVDF 轉膜90 分鐘、5%BSA 室溫封閉2 h、一抗4℃孵育、二抗室溫孵育1 h 等步驟，使用合肥Biosharp 公司的ECL 發光液顯色，在發光儀下拍照蛋白條帶，并用Image J分析條帶的相對灰度密度。

1.2.6 ROS 檢測

步驟按說明書執行，首先按照1∶1 000 用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μM；接著，去除對照組和丙泊酚處理組細胞的培養液，加入能夠覆蓋細胞的DCFH-DA 溶液，37℃細胞培養箱內孵育20 min，用無血清細胞培養液洗去未進入細胞內的DCFH-DA；最后，用熒光顯微鏡觀察拍照。每項實驗均重復3 次。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism 8 軟件進行統計分析，數據以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間采用方差分析。P＜0.05 時為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度丙泊酚對肝癌細胞增殖和遷移的影響

分別將兩株不同的肝癌細胞HepG2 和Huh7分成4 組，添加不同濃度的丙泊酚處理48 小時。CCK8 檢測結果顯示：終濃度為10 μg/mL 和20 μg/mL 的丙泊酚均可以顯著地抑制HepG2 和Huh7細胞的增殖，且抑制效果相仿，差異有統計學意義（F=34.06，P＜0.01；F=10.18，P＜0.01）（圖1A 和B）。同時，Transwell 結果實驗顯示：終濃度為10 μg/mL的丙泊酚可以抑制肝癌細胞的遷移（圖1C）。

圖1 丙泊酚對肝癌細胞生長和遷移的影響Figure 1 The effect of propofol on the proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells

2.2 抑制鐵死亡對丙泊酚調控肝癌細胞增殖和遷移的影響

圖2A 顯示，相比較于丙泊酚組，添加Fer-1 可以恢復丙泊酚對HepG2 和Huh7 細胞生長的抑制，差異有統計學意義（F=22.48，P＜0.01；F=23.13，P＜0.01）（圖2A 和B）；同時也能夠削弱丙泊酚對HepG2 和Huh7 細胞遷移的調控（圖2C）。

圖2 Fer-1 對丙泊酚抗肝癌作用的影響Figure 2 The effect of Fer-1 on the anti-hepatocellular carcinoma effect of propofol

2.3 鐵死亡激活劑協同丙泊酚對肝癌細胞生長和遷移的影響

如圖3A 所示，和對照組細胞相比，丙泊酚和RSL3 單獨作用均可以抑制HepG2 和Huh7 細胞的增殖，但是兩者聯合作用可進一步抑制肝癌細胞的生長，差異具有統計學意義（F=68.79，P＜0.01；F=24.60，P＜0.01）（圖3A 和B）。同時，相比較于對照組和單獨處理組，RSL3 和丙泊酚同時處理可以顯著地抑制HepG2 和Huh7 細胞的遷移（圖3C）。

圖3 RSL3 對丙泊酚抗肝癌功能的影響Figure 3 The effect of RSL3 on the anti-hepatocellular carcinoma effect of propofol

2.4 丙泊酚在肝癌細胞中對鐵死亡的調控

相比較于對照組，丙泊酚提高了細胞內的ROS 水平（圖4A）；Western blot 檢測表明丙泊酚沒有改變SLC7A11 和SLC3A2 的表達，但是減少了GPX4 的蛋白水平（圖4B 和C），差異有統計學意義（F=29.48，53.62，P＜0.01）。

圖4 丙泊酚對鐵死亡的影響Figure 4 The effect of Propofol on ferroptosis

3 討論

圍手術期麻醉處理對腫瘤患者預后具有重要的意義，丙泊酚作為一種烷基酚類的短效靜脈麻醉藥，除了廣泛用于麻醉誘導、麻醉維持及重癥監護病房的靜脈鎮靜外，丙泊酚還可影響不同類型腫瘤細胞的發生發展，且作用機制也具有組織差異性［1］。

丙泊酚在肝癌細胞中的作用雖然已有一些報道，但是分子機制較為復雜，涉及多種不同的信號通路和表觀遺傳的調控，如TGF-β1/Smad2 信號通路、ERK 信號通路、JAK2/STAT3 信通路和非編碼RNA 等。Li［3］等發現丙泊酚可能通過抑制PCNA和CD34 等蛋白水平、提高TGF-β1 的表達來抑制肝癌細胞的增殖和凋亡。在肝癌細胞株SMMC-7721荷瘤的BALB/c 小鼠中也觀察到丙泊酚通過劑量依賴性的方式減少肝癌細胞中PCNA，CD34和pAKT 的表達，抑制肝癌生長［7］。Fei et al 等［8］團隊證明了NET1 會調控丙泊酚對肝癌細胞株SMMC-7721 增殖和遷移的抑制，丙泊酚通過下調NET1 的 表 達 來 抑 制pERK 和VEGF 的 水 平。Li［9］研究發現在肝癌細胞株Huh7 和Bel-7405 中，丙泊酚可以提高miR-105 的水平，后者會靶向抑制JAK2 表達，導致JAK2/STAT3 信號活性降低，肝癌細胞的增殖受到抑制。除了miR-105，miR-195-5P的表達也受丙泊酚的調節［10］。丙泊酚可以提高順鉑對肝癌細胞的殺傷強度，主要的下游機制是通過誘導miR-195-5P 的表達，靶向降解CCNE1 信使RNA，所以添加miR-195-5P 的抑制劑會削弱順鉑致死功能。此外，Chang et al［11］發現丙泊酚處理會顯著減少肝癌細胞株SNU-449 和HuH-6中lncRNA CASC9 的水平，過表達后者可以促進肝癌細胞的增殖和轉移。進一步研究證明CASC9 通過與EZ2H2 相互作用負調控PTEN 的轉錄，而PTEN 是AKT/mTOR 信號通路的抑制成份［11］。本論文發現丙泊酚在肝癌細胞中可以通過調控GPX4的表達激活鐵死亡來發揮功能（圖4B 和C）。鐵 死 亡抑制肝癌發生發展的研究較多［6］，如Let［12］發現PCDHB14 會促進RNF182 調控的P65 泛素化，而P65 可以結合SLC7A11 啟動子從而激活其表達，所以PCDHB14 通過降低SLC7A11 從而激活鐵死亡來發揮抗肝癌的功能［12］。事實上，丙泊酚在其他類型的腫瘤中通過激活鐵死亡來抑制腫瘤細胞的生長和轉移已有報道，如乳腺癌、胃癌和結直腸癌等［4，13-14］。但是丙泊酚激活鐵死亡信號的詳細下游機制還需要深入地研究。

綜上所述，本論文揭示了丙泊酚抑制肝癌的新機制，豐富了丙泊酚抗癌機制的調控網絡。值得注意的是手術時需要的丙泊酚的血藥濃度在2.5～8.0 μg/mL，復合其他靜脈麻醉藥時所需血藥濃度會更低，而丙泊酚發揮抗癌作用的濃度則更高，作用時間也較長。此外，臨床上供選擇的非巴比妥類靜脈麻醉藥物也較多［15］，如依托咪酯、氯胺酮、羥丁酸鈉，它們在肝癌細胞中是否具有和丙泊酚相類的作用？聯合使用是否可以調控丙泊酚的功能？也值得未來進一步研究，結果將為在臨床上優化肝癌的治療方案提供新的參考和線索。