18F-FDG PET/CT顯像對大鼠心肌缺血-再灌注損傷能量代謝功能障礙的評價

韋麗虹，肖云峰，何玉林，趙振峰，張國建

(1. 內蒙古自治區國際蒙醫院藥學部，內蒙古 呼和浩特 0100651； 2. 內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010100； 3. 內蒙古醫科大學附屬醫院核醫學科，內蒙古 呼和浩特 010050)

在臨床實踐中對急性心肌梗死和不穩定心絞痛患者的最有效、最直接的治療方法是及時行經皮冠狀動脈介入治療或冠狀動脈搭橋術使病變血管再通，早期有效實現心肌血流再灌注，限制心肌梗塞面積擴大、防止左心室重塑，保證左心室收縮功能[1]，但心肌恢復血流灌注之后會帶來再灌注損傷的發生，可出現微血管損傷、心功能障礙、心律失常等改變，使心肌損傷進一步加重,即產生心肌缺血-再灌注損傷(Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury，MIRI)現象。

MIRI是心血管醫生面臨的巨大挑戰，一直是心血管疾病治療特別是心臟介入及心臟外科領域研究的熱點。關于MIRI發病機制的研究尚未完全闡明，大多數研究認為與心肌細胞能量代謝障礙、超微結構損傷、細胞內Ca2+超載、氧自由基損傷、白細胞的激活、粒細胞浸潤以及心肌細胞的凋亡等作用有關[2-6]。

有研究發現[7],心肌能量代謝障礙是MIRI的起始。心臟是生物體非常重要的器官，具有高耗氧、高耗能、高功能的特點，其本身的能量儲備很少，一旦發生缺血缺氧，心肌細胞的能量代謝方式迅速發生變化，ATP生成急劇減少，出現能量代謝障礙，使細胞的能量供給減少。研究認為[8]，心肌的能量代謝出現了障礙之后，心肌細胞基因的表達將會產生變化，ATP的水平可明顯影響著細胞壞死以及凋亡的產生。因此，對MIRI心肌能量代謝功能進行深入研究具有重要意義。

18F-FDG是核醫學檢查中廣泛應用的一種葡萄糖代謝類顯像劑，基于心肌對于葡萄糖的利用規律與特點，應用18F-FDG可在體外用核醫學設備PET/CT顯像，觀察葡萄糖在正常心肌與異常的心肌內的代謝分布情況，真實反映心肌正常、缺血和壞死等情況，在臨床上可以很好的針對有功能障礙心肌活力進行檢測[9]。本研究應用18F-FDG小動物 PET/CT顯像對SD大鼠MIRI葡萄糖能量代謝功能進行觀察，旨在探討MIRI的能量代謝功能障礙機制及變化規律。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Innovation Drive MM型Micro PET/CT(德國SIEMENS公司)；Minitrace型回旋加速器(美國GE公司)；Matrx VMR型麻醉機(美國MA-TRX公司)；V-100小動物呼吸機(上海玉研科學儀器有限公司)；ECG-3A型數字心電圖機(深圳市埃頓實業有限公司)；2.5%異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；3%戊巴比妥鈉(北京華業寰宇化工有限公司)

1.2 實驗動物與分組

健康雄性SD大鼠，清潔級，8月齡，體重285±50g，購置于內蒙古醫科大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(蒙)2016-0001。該實驗方案經內蒙古醫科大學倫理委員會批準，倫理審批文件編號(NO): YKD2017092。根據結扎大鼠冠狀動脈時間不同分為輕度缺血組(結扎10秒)、中度缺血組(結扎30秒)及重度度缺血組(結扎60秒)，每組SD大鼠20只。

1.3 MIRI模型制作

腹腔注射 3%戊巴比妥鈉 1mL·kg-1麻醉，仰臥位固定大鼠，經口腔行氣管插管，胸部去毛，75%酒精擦拭胸部皮膚消毒，于左鎖骨中線與左側第3～5肋間心臟搏動最強點開胸，暴露心臟，結扎冠狀動脈左前降支，根據實驗組別結扎10秒、30秒、60秒，心電圖檢測中的T波改變、心肌顏色由紅變淺，證實為心肌缺血造模成功，松解結扎線使血流再通，關閉胸腔，逐層縫合。所有模型鼠造模前、后各時段均記錄心電圖改變。

1.4 18F-FDG心肌顯像

所用顯像劑18F-FDG由內蒙古醫科大學附屬醫院自行制備，放射性化學純度均>98%，其他指標符合藥典要求。

SD模型大鼠自由飲食，將模型大鼠放置麻醉艙內，2.5%的異氟烷(V/V，異氟烷：氧氣)麻醉，成功后將模型鼠置于Micro PET/CT檢查床，俯臥位固定，再用3.5%異氟烷(V/V，異氟烷：氧氣)進行麻醉保持，注射18F-FDG 0.8mci，注射體積為0.2mL，詳細記錄分藥時間、注射時間，測定注射前及注射后殘余劑量。注射40～60分鐘后，行Micro-PET/CT掃描，先采集CT圖像，然后采集PET圖像，CT圖像采集條件：電壓 85KV，電350 uA；掃描層厚0.06 mm，PET采集10分鐘，采集視野FOV=12.7 cm，圖像經衰減校正處理，應用Feldkamp方法重建。

1.5 心肌病理結構觀察

所有顯像完成后模型鼠全部處死，對心臟組織進行常規HE染色進行心肌病理學觀察。離體心臟用固定液沖洗，將左心室前壁心肌組織切成條狀，放在固定液中2h，接著用0.09 mmol KH2PO4漂洗15min，并在此溶液中保存。依次常規酒精逐級脫水、二甲苯透明、常規石蠟包埋，間斷均勻切片，做HE染色，光鏡下觀察心肌病理結構改變。正常心肌染色均勻纖維完整，結構清晰，無水腫，無炎性浸潤。缺血受損心肌則表現染色不均，肌原纖維顯示欠清，嗜酸性增強。

1.6 數據處理及圖像判讀

通過SIEMENS Inveon MM工作站分別獲得CT和PET以及二者融合的圖像，由兩位高級職稱核醫學醫師盲法獨立閱片。

所有圖像都使用旋轉電影三維顯示方法(3D)進行分析。調整視窗的設置以獲得最佳的心臟顯示圖像。視覺分析方法判斷影像是否異常，判斷標準是連續兩個以上層面且其它體位相應的層面存在放射性分布稀疏或缺損判斷為陽性結果。同時在受損心肌的邊緣周圍手工繪制三維感興趣區域，并記錄受損心肌每一層面的感興趣區(ROI)平均值及SUVmean(平均感興趣區域的放射性活度/每克體重的放射性示蹤劑注入活度)，最后計算出心肌受損的體積(VOI)與SUVmean。意見不一致時相互討論決定。

1.7 統計分析

應用SPSS 22.0軟件進行數據統計分析，檢驗水準取α=0.05。所有測得數據資料均采用Mean±SD表示，顯像劑各時間點受損心肌的SUVmean動態變化及受損心肌體積變化比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示有差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MIRI模型建立

SD大鼠實驗過程中9只在造模過程中死亡，造模前麻醉意外死亡3只，顯像過程中麻醉死亡2只，開胸結扎冠脈出現急性心衰死亡4，最終60只大鼠完成造模并顯像，建模后心電圖顯示Ⅱ導聯ST段改變大于0.2mv、 Micro PET/CT顯像左心室壁18F-FDG攝取異常定義為模型建立成功(圖1～2)。

2.2 心肌組織病理學檢測

正常大鼠心肌細胞結構完整，肌纖維排列整齊，細胞核形態正常，心肌細胞無水腫。模型大鼠(重度缺血組)心肌結構損壞，肌纖維排列紊亂、腫脹斷裂，細胞核有固縮現象，并伴有炎癥細胞浸潤(圖3)。

2.3 不同程度缺血-再灌注后18F-FDG心肌顯像動態觀察

大鼠心肌輕、中、重度缺血再灌注后24小時和48小時18F-FDG顯像，各組可見不同程度顯像劑攝取稀疏-缺損區，72小時顯像時，輕度缺血組受損心肌恢復，中度缺血組基本恢復，而重度缺血組有部分受損心肌恢復，仍有部分受損心肌未恢復(圖6)，定量分析可見輕度缺血組受損心肌體積逐漸減小，72小時消失(F=136.58，P<0.05)，中度缺血組受損心肌體積逐漸減小，72小時仍有少部分受損心肌(F=121.42，P<0.05)，重度缺血組受損心肌體積逐漸減小，72小時仍有部分受損心肌存在(F=61.53，P<0.05)(圖4～5，表1)

表1 不同組別大鼠心肌受損體積(mm3)比較(n=60)

2.4 不同程度缺血-再灌注后受損心肌SUVmean變化

大鼠心肌不同程度缺血再灌注后受損心肌SUVmean隨時間延長逐漸增高，代謝逐漸恢復(F=415.39，P<0.05；436.47，P<0.05；361.42，P<0.05)，而24小時各組SUVmean存在統計學差異(F=30.62,P>0.05)，48小時各組SUVmean無統計學差異(F=10.62,P>0.05)，72小時各組SUVmean無統計學差異(F=2.17，P>0.05)(表2，圖6)。

圖1 A 正常SD大鼠心電圖；B SD大鼠MIRI模型心電圖，Ⅱ導ST段壓低0.2mv以上，紅色箭頭所示

圖2 A 正常心肌代謝顯像，心室各室壁18F-FDG攝取均勻；B MIRI模型代謝顯像，左心室心尖部18F-FDG攝取稀疏(陽性)(紅色箭頭所)。

圖4 A 24小時顯像，B 48小時顯像，C 72小時顯像

圖5 不同組別各時間點受損心肌體積變化情況

表2 不同組別大鼠心肌SUVmean動態變化比較(n=60)

圖6 不同組別各時間點受損心肌SUVmean變化情況

3 討論

目前認為MIRI發生的基礎是心肌能量代謝功能發生障礙[7]，因此可以通過能量代謝顯像評價MIRI的發生、損傷程度、范圍等。當心肌缺血時心臟功能及心肌細胞會發生一系列的變化，包括心肌血流灌注減低，能量代謝減低及室壁運動異常等。心肌血流灌注減低是其它異常發生的基礎，短時間內血流可以恢復，但是代謝減低則恢復較慢，將持續較長時間。這種機制是心肌自我保護的過程。這樣，心肌就可以適應較長時間的缺血狀態。

有學者研究發現[10]，當心肌的能量代謝發生障礙，可導致心肌細胞的基因表達異常，ATP水平下降，使細胞膜上鈉鈣交換蛋白的活性下降，產生鈣內流的增加，產生細胞內鈣超載，同時促進氧自由基的堆積，大量的氧自由基進一步導致心肌受損。

我們的研究通過對輕、中、重度MIRI大鼠模型進行研究，在不同時間節點動態觀察心肌葡萄糖代謝的變化規律。結果發現，不同程度的心肌缺血隨灌注時間延長，心肌葡萄糖代謝損傷范圍逐漸減小，程度逐漸減輕，SUVmean隨時間延長逐漸增高，對于輕、中度心肌缺血，再灌注后葡萄糖代謝障礙可持續到48小時，重度者則持續72小時以上。SUVmean逐漸升高原因是18F-FDG在心肌細胞內攝取隨時間延長逐漸增高，即心肌的能量代謝障礙逐漸減輕。三組的SUVmean在初期的24小時有明顯差別，而在之后48小時及72小時差別逐漸減小。

正常情況心臟的主要能量代謝底物主要包括葡萄糖、乳酸、脂肪酸，當心肌氧充足供應時，以脂肪酸作為主要代謝底物，當糖攝入量增時，脂肪細胞釋放游離脂肪酸減少，心肌則轉變為以葡萄糖代謝為主。對缺血心肌而言，葡萄糖代謝會上調，而脂肪酸代謝則下降。因而對于缺血心肌能量代謝起關鍵作用的是葡萄糖，脂肪酸決定非缺血性心肌的能量代謝調節。18F-FDG是葡萄糖類似物，因此心肌攝取18F-FDG與血液中葡萄糖代謝底物水平密切相關。飲食狀態會影響血液中葡萄糖及胰島素濃度，進而使心肌攝取18F-FDG產生變化。因此，會根據不同目的需要，在顯像準備前有針對性的將飲食狀態進行調整[11-12]。

特別說明的是，本研究應用飲食狀態下的大鼠進行的相關研究。以往的文獻報道多是研究空腹狀態下心肌18F-FDG攝取[13-15]，認為患者禁食狀態下心肌缺血使葡萄糖攝取提高，正常心肌18F-FDG也有不同程度攝取增高。因此易與缺血心肌混淆。本實驗開始之前進行了飲食與空腹兩種狀態18F-FDG代謝顯像對比研究，研究結果提示飲食狀態下18F-FDG心肌顯像和空腹狀態下心肌受損范圍相似，因而可以應用飲食狀態替代經典空腹狀態18F-FDG PET/CT顯像檢測心肌缺血。

此外，以往的文獻報道認為冠狀動脈阻斷持續時間≥15min后人類和犬缺血再灌注后區域性心肌血流量減少[16]，但對于大鼠急性心肌缺血模型阻斷冠狀動脈血流持續時間的報道說法不一或相關針對性的研究較少，本課題組經過探索，確定本實驗大鼠重度心肌缺血時間窗為結扎冠狀動脈60秒。與其他相關報道有一些差別，今后研究中我們將進一步摸索求證。

本研究為臨床提供了一種能夠在活體上評價MIRI的無創性影像學方法，也證實了不同程度MIRI的恢復有不同的時間窗，對于臨床醫生治療決策的制定具有指導意義。

利益沖突 本研究由署名作者獨立開展，不涉及任何利益沖突。